酶解血粉制備氨基酸水溶肥工藝條件優(yōu)化

張洪志，沈 濤，杜新園，楊育乾

（寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，寧夏 銀川 750000）

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，2019 年我國豬、牛、羊肉產(chǎn)量為8 363 萬t，屠宰加工過程中產(chǎn)生近50%的廢棄物，其中血液占30%左右。除作為工業(yè)原料及蛋白飼料外，大部分血液作為廢棄物被排放，導(dǎo)致環(huán)境污染和資源浪費(fèi)［1］。利用動(dòng)物血液生產(chǎn)氨基酸水溶肥是變廢為寶的途徑之一。氨基酸是目前農(nóng)資市場中使用量較大的一種生物刺激素，可以作為一種有機(jī)氮源為植物代謝過程提供氮素，作為結(jié)構(gòu)性分子用于合成蛋白質(zhì)大分子，另外可以作為功能性分子參與植物各種生理活動(dòng)［2］。丁恒毅［3］發(fā)現(xiàn)氨基酸肥料可以提升茶葉品質(zhì)，增加茶葉中茶多酚、氨基酸、咖啡因等的含量，同時(shí)增強(qiáng)茶葉的口感；周輝軒等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在桃樹幼苗期噴施氨基酸水溶肥能夠顯著促進(jìn)幼苗的生長發(fā)育。蛋白多肽是一種新型的植物激素，其分子量比蛋白質(zhì)更小，可以直接被植物吸收利用，葉面噴施蛋白多肽能促進(jìn)植物干物質(zhì)的積累，增強(qiáng)植物光合作用［5］，促進(jìn)土壤微生物種群增加，有利于植物對鉀、鈣、鎂、鐵、鈉等元素的吸收［6］。

目前，國內(nèi)對利用商業(yè)化蛋白酶酶解動(dòng)物血液制備氨基酸水溶肥的研究較少，且主要集中在動(dòng)物血液廢棄物分解菌的篩選和鑒定等方面的基礎(chǔ)研究。周毅等［7］對生豬屠宰場下水道土壤中的微生物進(jìn)行分離，獲得一株產(chǎn)酶能力較高的菌株B12，所產(chǎn)蛋白酶活力最高可達(dá)185.58 U/mL；周雪雁等［8］以屠宰場廢棄血液堆積處土壤樣品為材料，獲得了能夠有效降解廢棄血液的功能菌株，其蛋白酶活力為188.63 U/mL；蔡藝菲等［9］以豬血為原料，利用風(fēng)味蛋白酶水解豬血中的蛋白質(zhì)，在液料體積質(zhì)量比10.5 mL/g、pH 6、水解溫度50 ℃、每克蛋白酶活力為12 000 U、水解時(shí)間7 h的條件下，蛋白水解度為40.42%。

利用商業(yè)化蛋白酶水解血液制備氨基酸水溶肥的研究雖有報(bào)道，但是蛋白水解度不高，氨基酸產(chǎn)率低。本實(shí)驗(yàn)利用組合蛋白酶探究酶解參數(shù)對酶解效果的影響，提高血粉蛋白的水解度，增加酶解液中氨基酸含量，為蛋白酶酶解血液制備氨基酸水溶肥的過程控制及規(guī)模化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

干燥血粉（血液噴霧干燥制成），由青島中科興海生物科技有限公司提供，w（蛋白質(zhì)）87.5%。

蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C（均由枯草芽孢桿菌表達(dá)，水解度不同），以及胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶5 種蛋白酶均由寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸銅、三氯乙酸、硼酸、硫酸，均為國產(chǎn)分析純；19 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；乙腈、亮氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（多肽分析所用標(biāo)準(zhǔn)品）、血管緊張素Ⅱ、阿太地爾、細(xì)胞色素C，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血粉酶解工藝

將血粉與純化水按照一定比例混合后，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)料液pH，加入一定量的蛋白酶，在規(guī)定的溫度下恒溫?cái)嚢杳附庖欢〞r(shí)間，酶解結(jié)束后于90 ℃水浴鍋中滅酶15 min，冷卻，測定蛋白水解度、酶解液氨基酸含量等指標(biāo)。分別考察液料比、原料預(yù)處理溫度、蛋白酶種類及組合酶比例對血粉酶解效果的影響。

1.2.2 組合酶水解工藝

在確定組合酶比例的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化血粉酶解工藝，以溫度、酶制劑添加量、pH 和時(shí)間為因素，以血粉蛋白水解度為指標(biāo)，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化組合酶水解血粉工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.3 分析檢測

總氮含量測定：參照GB 5009.5—2016，采用凱氏定氮法測定［10］。

水解度測定：稱取酶解液4 g 置于10 mL 離心管中，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的三氯乙酸溶液4 mL，振蕩至均一，然后靜置30 min，再在轉(zhuǎn)速8 000 r/min的離心機(jī)中離心10 min。稱量上清液，并測定其總氮含量，計(jì)算水解度（水解度=上清液中總氮質(zhì)量/酶解液中總氮質(zhì)量）。

氨基酸含量測定：參照NY/T 1975—2010，采用柱前衍生-液相色譜儀法測定［11］。

多肽分布測定：參照GB/T 22492—2008，采用高效凝膠過濾色譜法測定［12］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

正交實(shí)驗(yàn)分析由SPSS V17 完成；圖由Origin 8.0（美國OriginLab公司）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶C 添加量為1.0%、pH 為7.0、時(shí)間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，研究液料比對血粉酶解效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 液料比對血粉酶解效果的影響

由圖1a.可知，隨著血粉濃度降低，料液中蛋白質(zhì)含量不斷下降。由圖1b.可知，當(dāng)液料體積質(zhì)量比在4～6 mL/g 范圍內(nèi)，血粉蛋白質(zhì)的水解度隨著血粉濃度降低而增加；液料體積質(zhì)量比在6～8 mL/g范圍內(nèi)，血粉蛋白質(zhì)的水解度隨血粉濃度降低而降低。因此，選擇6 mL/g作為較佳的液料體積質(zhì)量比（后續(xù)實(shí)驗(yàn)液料體積質(zhì)量比均為6 mL/g），此時(shí)料液中w（蛋白質(zhì)）為12.50%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與復(fù)合蛋白酶在不同液料比條件下水解效果基本一致［13］。在酶促反應(yīng)過程中，不同的底物濃度對酶制劑的酶解效果具有顯著影響［14］。研究表明，在一定范圍內(nèi)，隨著底物濃度不斷增加，酶與底物結(jié)合達(dá)到飽和，底物濃度增加反應(yīng)效率不再提高［15］，反而因底物濃度過大，降低酶在溶液中的擴(kuò)散能力，而且過量底物可能通過分子間作用力與酶結(jié)合形成中間產(chǎn)物，抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行，使得蛋白水解度降低［16］。

2.1.2 原料預(yù)處理溫度對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶C 添加量為1.0%、pH 為7.0、時(shí)間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，探究了在不同預(yù)處理溫度下加熱10 min對血粉酶解效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 原料預(yù)處理溫度對血粉酶解效果的影響

由圖2 可知，對照組（常溫）血粉蛋白水解度及酶解液w（氨基酸）分別為44.57%和3.41%；當(dāng)預(yù)處理溫度為70、75 ℃時(shí)，血粉蛋白水解度及酶解液氨基酸含量結(jié)果與對照組相當(dāng)；當(dāng)預(yù)處理溫度為80～90 ℃時(shí)，血粉蛋白水解度及酶解液氨基酸含量有所增加，處理溫度為90 ℃時(shí)提高幅度最大，血粉蛋白水解度及酶解液w（氨基酸） 分別為46.13%和3.64%。

蛋白質(zhì)在變性過程中，維系其空間結(jié)構(gòu)的次級鍵被破壞，原有空間結(jié)構(gòu)解體，分子由緊密球形結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮⒌臒o特定空間結(jié)構(gòu)的鏈狀［17］。原料在酶解前，通過物理加熱手段使蛋白質(zhì)適當(dāng)變性，釋放酶切位點(diǎn)，為后續(xù)高效酶解提供基礎(chǔ)［18］，熱處理能破壞蛋白質(zhì)的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)，打開氫鍵、S—S 鍵及疏水鍵，使多肽鏈完全展開；由于分子結(jié)構(gòu)松散，那些原來包藏在分子內(nèi)部的易與酶發(fā)生作用的部位暴露出來，從而使蛋白水解酶的作用點(diǎn)大大增加，提高酶解速度；但若加熱過度，松散的多肽鏈又會(huì)由于S—S 鍵和疏水鍵的再生而結(jié)合更加緊密，反而阻礙酶對蛋白的水解作用［19］。劉元林［20］研究發(fā)現(xiàn)，對堿性蛋白酶而言，僅低溫短時(shí)預(yù)處理（75 ℃，5 min）可促進(jìn)蛋白水解；對風(fēng)味蛋白酶而言，除低溫長時(shí)預(yù)處理（75 ℃，15 min）蛋白水解度與空白組無顯著性差異外，其他處理水解度都顯著低于空白組。張婷等［21］利用多元線性回歸法優(yōu)化出最佳熱變性條件，w（血紅蛋白）5%時(shí)40 ℃熱變處理2.5 h 后，酶解血紅蛋白制備亞鐵血紅素產(chǎn)率達(dá)到10.42 mg/mL，較未經(jīng)熱變性處理提高了30.02%。

根據(jù)本研究結(jié)果可知，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著預(yù)處理溫度升高，血粉酶解效果有所提升，但是提升幅度不大，沒有顯著促進(jìn)效果。在加熱過程中血塊熟化，完全失去流動(dòng)性，不利于酶與蛋白接觸，并且會(huì)沾到容器壁，對設(shè)備攪拌功能要求較高，同時(shí)成本會(huì)上升。因此，不建議對原料進(jìn)行熱變性處理。

2.1.3 蛋白酶種類對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶添加量為1.0%、pH 為7.0、時(shí)間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，研究蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對血粉酶解效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 蛋白酶種類對血粉酶解效果的影響

由圖3 可以看出，蛋白酶B 的水解效果最好，血粉蛋白水解度為49.36%，酶解液中w（氨基酸）為3.95%；與其他蛋白酶相比，風(fēng)味蛋白酶在對血粉蛋白水解上表現(xiàn)一般，但是在提高酶解液中氨基酸含量上具有較明顯的作用，w（氨基酸）高達(dá)4.02%。風(fēng)味蛋白酶主要以外切酶為主，在對蛋白質(zhì)進(jìn)行水解的同時(shí)，可以從多肽末端切下更多的氨基酸。因此，選擇蛋白酶B 和風(fēng)味蛋白酶組合進(jìn)行酶解研究。在酶促反應(yīng)過程中，酶具有專一性，不同蛋白酶對蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)不一樣，因此蛋白酶的選擇對血粉的酶解效率至關(guān)重要［22］。組合酶的使用對提高蛋白質(zhì)水解度，得到高質(zhì)量產(chǎn)物有非常重要的意義，內(nèi)切酶對提高水解度效果較理想，外切酶能將氨基端的氨基酸水解為游離氨基酸［23］。劉成梅等［24］建立中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶同步酶解鴨血蛋白工藝，得到的小分子肽無異味且苦味輕；江霞等［25］采用風(fēng)味蛋白酶與胰酶同步添加酶解工藝，提高了豬血蛋白水解度，獲得更加豐富的小分子肽及游離氨基酸產(chǎn)物；于美娟等［26］研究結(jié)果表明，組合酶水解豬血紅蛋白效果優(yōu)于單一酶水解效果，彌補(bǔ)了兩種酶單獨(dú)酶解時(shí)的不足。

2.1.4 組合酶比例對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶添加總量為1.0%、pH 為7.0、時(shí)間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，研究蛋白酶B 和風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比對血粉酶解效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 m（蛋白酶B）∶m（風(fēng)味蛋白酶）對血粉酶解效果的影響

由圖4 可以看出，一開始隨著風(fēng)味蛋白酶占比提高，組合酶對血粉的水解效果提升，但隨著風(fēng)味蛋白酶占比進(jìn)一步提升，組合酶對血粉的水解效果反而下降。因此選擇m（蛋白酶B）∶m（風(fēng)味蛋白酶）為2 ∶1進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 組合酶水解血粉正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為提高血粉蛋白酶水解度，增加酶解液中氨基酸含量，在m（蛋白酶B）∶m（風(fēng)味蛋白酶）為2∶1 的條件下，以溫度、酶制劑添加量、pH 和時(shí)間為因素，以血粉蛋白水解度為指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 組合酶L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，溫度對血粉蛋白酶解產(chǎn)生主要作用，其次是組合酶添加量、pH和時(shí)間。較佳酶解工藝參數(shù)為溫度55 ℃、組合酶添加量3.0%、pH 8.0、時(shí)間12 h，此時(shí)血粉蛋白水解度為67.26%。

2.3 血粉酶解液中游離氨基酸分析

采用液相色譜儀檢測最佳酶解條件下的酶解液中氨基酸種類與質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

表3 最佳酶解條件下血粉酶解液中氨基酸檢測結(jié)果

由表3可知，血粉酶解液中共含有19種游離氨基酸。經(jīng)計(jì)算，游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.39%，占總蛋白質(zhì)的51.12%（酶解液中總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.50%）。酶解液中丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.50%以上，蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.30%以上。尤其是亮氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)0.79%，占料液總蛋白質(zhì)的6.32%。

2.4 血粉酶解液中多肽分析

采用液相色譜儀檢測最佳酶解條件下所得酶解液中多肽分布，混合多肽標(biāo)樣色譜圖及酶解液中多肽分布色譜圖分別見圖5、圖6，酶解液中多肽分子量分布見表4。

圖5 混合多肽標(biāo)樣液相色譜圖

圖6 酶解液中多肽分布液相色譜圖

表4 酶解液中多肽分子量分布

由圖6 及表4 可知，酶解液中多肽分子量在1 046 Da 以下的占比達(dá)到99.59%，其中多肽分子量在451～1 046 Da 的占比為3.66%，在131～＜451 Da 的占比為35.77%，分子量小于131 Da 的產(chǎn)物（小肽、氨基酸等）占比達(dá)60.17%。

3 結(jié)論

血粉的最佳酶解工藝為液料體積質(zhì)量比6 mL/g、溫度55 ℃、組合酶添加量3.0%、pH 8.0、時(shí)間12 h，其中組合酶中蛋白酶B與風(fēng)味蛋白酶質(zhì)量比為2∶1。在該工藝條件下，血粉蛋白水解度為67.26%，酶解液中19種游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.39%，分子量在1 046 Da以下的多肽占比達(dá)到99.59%。通過對血粉酶解工藝的優(yōu)化，提高了血粉蛋白的水解度，增加酶解液中氨基酸含量。該酶解工藝時(shí)間短，效率高，操作簡單，易于工廠大規(guī)模生產(chǎn)，為蛋白酶酶解血液制備氨基酸水溶肥的過程控制及規(guī)模應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。