HPLC-MS/ MS 法同時測定微量血漿中甲氨蝶呤、左乙拉西坦、拉莫三嗪濃度及其臨床應用

秦亞彬 張古英 趙德運

河北省兒童醫院藥學部，河北石家莊 050031

甲氨蝶呤是抗葉酸類抗腫瘤藥，廣泛應用于急性淋巴細胞白血病、淋巴瘤等疾病的化療[1-2]。研究顯示，常規監測甲氨蝶呤血藥濃度可以有效降低不良反應發生率[3-5]。左乙拉西坦和拉莫三嗪為第二代抗癲癇藥，在患兒中有較好的療效[6-8]。左乙拉西坦和拉莫三嗪聯合應用或用于兒童、孕婦和肝腎功能異常的患者時，建議監測血藥濃度[9-10]。

甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪均屬于兒童治療藥物監測的常規品種[11-12]。實際臨床治療過程中存在癲癇患者聯合使用兩種抗癲癇藥的現象，癲癇合并白血病患者有兩種藥物聯用的可能。甲氨蝶呤和左乙拉西坦均為P-糖蛋白底物，兩者聯用可導致甲氨蝶呤的藥動學參數發生變化，繼而影響其濃度，增加腎毒性[13]。

HPLC-MS/MS 法具有良好的分離能力和選擇性，可以同時檢測多種藥物，近年來被廣泛用于治療藥物的監測工作[14-15]。兒童血管細小，采血困難。故本研究嘗試采用微量血漿樣本，建立同時測定甲氨蝶呤、左乙拉西坦、拉莫三嗪濃度的HPLC-MS/MS 法，以用于患兒血藥濃度監測，為合理用藥提供保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent Ultivo 三重四極桿質譜儀（美國安捷倫公司）；低溫高速離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；渦旋混合器（杭州佑寧儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100138-201704，純度：99.4%）；內標甲氨蝶呤-D3（上海源葉生物有限公司，批號：H17M9Q56012，純度＞98.0%）；左乙拉西坦（成都德思特生物技術有限公司，批號：DST-190223-028）；內標左乙拉西坦-D6，（深圳海思安生物技術有限公司，批號：30001101，純度：98%）；拉莫三嗪（中國食品藥品檢定研究院，批號：100775-201902，純度：99.7%）；內標拉莫三嗪-13C3-D3（深圳海思安生物技術有限公司，批號：30002385，純度：98%）；甲醇為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸為色譜純（美國MREDA 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；血漿均來源于河北省兒童醫院。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 色譜條件 分析柱為Agilent C18（50mm×2.1mm，1.8μm）；流動相0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）梯度洗脫（0.00～0.50 min，98%→95%A；0.50～1.50 min，95%→5%A；1.50～2.40 min，5% A；2.41～2.50 min，95% →98% A；2.50～3.50 min，98%A）；柱溫：45℃；自動進樣器溫度：8 ℃；流速為0.4 ml/min；進樣體積：3 μl。

2.1.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源，正離子模式；鞘氣溫度：280 ℃，鞘氣體積流量：11 L/min；噴嘴電壓：500 V；霧化器壓力：15 psi；毛細管電壓：正電壓4 000 V；干燥氣溫度：300 ℃，干燥氣體積流量7 L/min；多反應監測掃描分析。

離子通道選擇：甲氨蝶呤m/z 455.1→308.2，內標甲氨蝶呤-D3 m/z 458.1→311.1；左乙拉西坦m/z 171.1.4→126.2，內標左乙拉西坦-D6 m/z 177.2→132.2；拉莫三嗪m/z 256.1→211，內標拉莫三嗪-13C3-D3 m/z 262.1→217.1。碰撞能均為20 eV。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品及內標溶液制備 準確稱取甲氨蝶呤10.3 mg 置于50 ml 容量瓶中，左乙拉西坦、拉莫三嗪各20 mg 置于5 ml 容量瓶中，甲氨蝶呤-D3、左乙拉西坦-D6、拉莫三嗪-13C3-D3 各1 mg 用甲醇/ 水（V/V=1/1）分別溶解，超聲助溶并稀釋至刻度，獲得儲備液。用甲醇/水（V/V=1/1）對儲備液逐級稀釋獲得一系列濃度對照品的標準溶液及500 ng/ml 甲氨蝶呤-D3、30 μg/ml 左乙拉西坦-D6 和15 μg/ml 拉莫三嗪-13C3-D3 的混合內標溶液，-80℃冷凍保存。

2.2.2 標準曲線和質控樣品制備 精密吸取50 μl 甲氨蝶呤、50 μl 左乙拉西坦和50 μl 拉莫三嗪各濃度標準溶液加入離心管中，再加入1 850 μl 空白血漿渦旋混勻，制成6 個濃度系列的混合標準曲線。甲氨蝶呤的濃度為25、50、100、500、1 000、1 500 ng/ml，左乙拉西坦的濃度為1、2、5、10、25、50 μg/ml，拉莫三嗪的濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0 μg/ml。

另取適量儲備液用空白血漿稀釋制得3 個濃度水平的混合質控樣品。其中甲氨蝶呤的質量濃度為75、300、1 200 ng/ml，左乙拉西坦的質量濃度為3、20、40 μg/ml、拉莫三嗪的質量濃度為1.5、10.0、20.0 μg/ml。

2.3 樣品前處理

精密吸取10 μl 血漿樣本，加入10 μl 混合內標溶液和100 μl 甲醇，渦旋1 min，11360 r/min 離心10 min，離心半徑為50 mm，取50 μl 上清液，用水稀釋5 倍后轉移至進樣瓶供進樣分析。

2.4 方法學驗證

根據《中華人民共和國藥典》[14]生物樣品定量分析方法驗證指導原則，從選擇性、殘留、定量下限、校準曲線、準確度和精密度、稀釋可靠性及穩定性方面對方法進行驗證。

2.4.1 特異性考察 取6 個不同批次的空白血漿以等體積的甲醇/水（50/50）替代內標溶液，按“2.3”項下方法處理分析，記錄空白血漿樣品色譜圖。另取上述6 份空白血漿配制成分析物標準血漿溶液，按“2.3”項下方法處理后進樣，記錄待測物和內標物的色譜圖。結果顯示，血漿中內源性物質不干擾甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪及其內標物的測定。見圖1。

圖1 左乙拉西坦、拉莫三嗪和甲氨蝶呤及內標物的典型色譜圖

2.4.2 標準曲線與定量下限 將“2.2.2”項下6 個濃度的樣品，按“2.3”項下方法處理后進樣檢測。采用最小二乘法進行回歸擬合，求得直線回歸方程并計算校正標樣濃度。甲氨蝶呤在25～1 500 ng/ml 線性關系良好，標準曲線方程：Y=0.251 6X+0.003 4（r=0.998 9），定量下限為25 ng/ml；左乙拉西坦在1～50 μg/ml 線性關系良好，標準曲線方程：Y=16.687 6X+0.000 2（r=0.991 1），定量下限為1 μg/ml；拉莫三嗪在0.5～25.0 μg/ml 線性關系良好，標準曲線方程：Y=46.369 5X-0.059 9（r=0.999 1），定量下限為0.5 μg/ml。定量下限信噪比均＞5，符合定量要求。

2.4.3 精密度與準確度 混合質控樣品和定量下限濃度樣品按“2.3”項下方法處理后進樣測定，每個濃度平行測定5 份，批內及批間準確度和精密度結果均符合要求。見表1。

表1 批內及批間精密度及準確度結果

2.4.4 基質效應取6 個不同個體來源的空白血漿，按“2.3”項下方法配置低、高濃度的混合質控樣品，分別計算經內標歸一化后的基質效應因子及變異系數（coefficient of variation，CV）。結果顯示，經內標歸一化后，各化合物基質效應因子的CV 均＜15%，樣品測定不受基質的影響。見表2。

表2 各待測藥物在人血漿中的基質效應

2.4.5 殘留效應 系統殘留分析是對定量上限樣品分析后立即分析空白血漿樣品。要求殘留不超過待測物定量下限的20%，不超過內標峰面積的5%。結果顯示，殘留符合接受標準。

2.4.6 稀釋可靠性 分別配制高于定量上限的標準樣品，其中甲氨蝶呤質量濃度為30 μg/ml、左乙拉西坦和拉莫三嗪濃度均為100 μg/ml，用空白血漿稀釋上述樣品，使稀釋后樣品質量濃度在標準曲線的線性范圍內，平行5 份，計算稀釋后樣品測定結果的準確度和精密度。結果均＜15%，符合標準。

2.4.7 穩定性 制備低、高濃度水平的混合質控樣品，分別考察室溫放置24 h、-20 ℃凍存2 周、反復凍融3次及自動進樣器保存12 h 的穩定性。結果顯示，甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪在以上條件下均不影響其測定準確度。見表3。

表3 穩定性結果

2.5 臨床應用

建立的檢測方法經驗證后應用于治療藥物監測。2022 年10 月至2023 年3 月共檢測了1 348 例患兒樣本。患兒采血后置于EDTA 抗凝采血管，4 000 r/min離心10 min，離心半徑為100 mm，取血漿；按“2.3”項下方法處理后檢測。共檢測甲氨蝶呤360 例，均為腫瘤維持性化療患兒，大劑量輸注甲氨蝶呤后24、48、72 h采血，其測定范圍在0.055～132.350 μmol/L。左乙拉西坦830 例、拉莫三嗪158 例，均為癲癇患兒，口服左乙拉西坦或拉莫三嗪1 周以上（達穩態后），于清晨服藥前采血（谷濃度），左乙拉西坦測定范圍在1.00～44.19 μg/ml；拉莫三嗪測定范圍在0.50～17.68 μg/ml。本研究經河北省兒童醫院醫學研究倫理委員會批準（醫研倫審第202210 號）。

3 討論

文獻報道，HPLC-MS/MS 法主要用于同時測定多種理化性質相似的同類藥物[15-17]。而本研究嘗試同時檢測理化性質相差較大不同類藥物。在優化色譜和質譜條件時，嘗試了不同比例的流動相和添加劑，最終采用梯度洗脫并且流動相添加甲酸的方法，使甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪均有合適的保留時間，峰形較好，無拖尾現象，可以滿足檢測要求。另外，與已知方法比較，本研究只需要10 μl 血漿，非常適用于兒童等采血困難群體[18-21]。

在生物樣本分析的前處理方法中，蛋白沉淀法因其處理簡便，易于操作，廣受青睞[22]。本研究選擇甲醇作為沉淀劑，待測物有足夠的提取回收率，可以滿足檢測需求。樣品前處理采用蛋白沉淀法，往往不能完全去除蛋白、鹽類和磷脂，這些內源性干擾能引起基質效應[23]。本研究中采用與待測物結構相似的同位素標記作為內標，以降低基質效應的干擾。同位素內標具有與待測物相同的色譜行為，是HPLC-MS/MS 法最合適的內標[24]。另外，樣品經蛋白沉淀法后的上清液，加水稀釋5 倍后再進樣，以降低基質干擾[25]。

本研究建立了可以同時測定血漿中甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪的HPLC-MS/MS 法，該方法可以用于治療藥物監測，也適用于藥物相互作用及藥動學研究，為藥物的合理使用提供參考依據。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。