高效液相色譜法指紋圖譜結合化學模式識別對除濕丸質量控制研究

楊 薇 龔 韜 宋京美 王 夏 胡銀燕 嚴文利 周德勇孫麗蘊

1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院北京市中醫藥研究所，北京 100035；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院皮膚科，北京 100010

除濕丸為首都醫科大學附屬北京中醫醫院院內制劑，由地黃、白鮮皮、茜草等中藥組成，具有清熱涼血，祛濕解毒的功效[1-4]?？诜? g/次，2 次/d。其所含的黃芩苷、黃芩素、梔子苷、連翹酯苷A 等都具有抗炎抑菌作用[5-13]。原質量標準僅收載了顯微及薄層色譜鑒別，無法全面反映復方制劑內在質量。中藥高效液相色譜法指紋圖譜具有專屬性高、整體性強等特點，能夠彌補單一化學成分質量控制的弊端，從而對其進行質量控制[14-20]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SHIMADZU SPD-M20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；XP105DR 電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司；雙量程：31/120 g，精度0.01/0.1 mg）；KX-2127QT超聲波清洗機（北京科璽世紀科技有限公司）；ELGA LabWater 水純化系統（法國威立雅水務集團）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對照品 連翹酯苷A（批號：111810-201707）、黃芩苷（批號：110715-201821）、丹皮酚（批號：110708-201407）、漢黃芩苷（批號：112002-201501）、大葉茜草素（批號：110884-200604）、漢黃芩素（批號：111514-201706）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；梔子苷（批號：110749-200410）、羥基茜草素（批號：111898-201101）對照品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2.2 樣品 所用飲片及29 批除濕丸樣品均由首都醫科大學附屬北京中醫醫院提供，除濕丸樣品批號見表1。

表1 29 批除濕丸樣品批號

1.2.3 試劑 甲醇（分析純，北京市通廣精細化工品公司）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸（色譜純，天津市光復科技發展有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Luna Omega Polar C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫：0%～5 min，99%B；5～70 min，99→65%B；70～90 min，65%→45%B；90～110 min，45%→10%B；110～120 min，10%B；120～130 min，10%→99%B；130～140 min，99%B；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

精密稱定除濕丸（批號：2007007）粉末0.25 g，置50 ml 具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇15 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）30 min，取出，放冷，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗 取“2.2”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件下進樣6 針，以23 號黃芩素為參照峰（S），計算共有峰的相對保留時間和相對保留面積RSD ≤4.60%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性實驗 取“2.2”項下供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h 進樣，以23 號黃芩素為參照峰（S），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD≤4.56%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.3.3 重復性實驗 取同一批樣品（批號：2007007）6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。以23 號黃芩素為參照峰（S），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD≤3.61%，表明該方法重復性良好。

2.4 高效液相色譜法指紋圖譜建立及相似度評價

將29 批除濕丸樣品按“2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件進行色譜分析。將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，共確定了35 個共有峰（圖1）。29 批除濕丸樣品（S1～S29）高效液相色譜法指紋圖譜見圖2，S1-S29 對應批號見表1。29 批除濕丸樣品的指紋圖譜相似度均≥0.973，表明不同批次除濕丸中主要物質群差異性小，制備工藝較穩定，形成的對照圖譜能夠作為衡量除濕丸制劑的標準參照物，結果見表2。

表2 29 批除濕丸樣品的相似度

圖1 除濕丸共有模式

圖2 29 批除濕丸樣品的高效液相色譜指紋圖譜

圖3 單味飲片及除濕丸物質基準相關性色譜圖

2.5 除濕丸共有峰的歸屬研究及化學計量統計分析

2.5.1 共有峰的歸屬研究 按照“2.2”項下方法分別制備各單味藥材供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行分析，對除濕丸指紋圖譜進行色譜峰歸屬。結果顯示，除濕丸指紋圖譜的35 個共有峰中9、10、12、13、16、18、19、20、22、26、31、33 號峰峰來自茜草；7、10、14、15、17、18、23、25、26、27 號峰來自黃芩；2、3、4、10、11、18 號峰來自牡丹皮，18、30～35 號峰來自茯苓皮；4、5、13、18 號峰來自炒梔子；8、28、29 號峰來自連翹；18、24 號峰來自威靈仙：18、28、32 號峰來自紫草；28 號峰來自當歸：18 號峰來自豬苓，結果見圖3。

2.5.2 主要色譜峰的指認在標定的35 個色譜峰中指認出8 個色譜峰，其中5 號峰為梔子苷，8 號峰為連翹酯苷A，15 號峰為黃芩苷，17 號峰為漢黃芩苷，18號峰為丹皮酚，23號峰為黃芩素，25 號峰為漢黃芩素，26 號峰為羥基茜草素，33 號峰為大葉茜草素（圖4）。并選定23 號峰為參照峰。

圖4 混合對照品色譜圖

2.5.3 聚類分析 將29 批除濕丸樣品35 個共有峰的相對峰面積輸入SPSS 22.0 軟件，對樣品進行系統聚類，采用組建連接法，以歐式距離為分類依據。當歐氏距離＞15 時，29 批樣品聚為3 類，其中S1～S16 聚為一類、S17～S26 聚為一類、S27～S29 聚為一類，見圖5。由聚類分析結果可以看出，除濕丸整體質量較為穩定，但不同批次除濕丸間存在差異，并與生產日期有明顯相關性。

圖5 29 批除濕丸聚類分析樹狀圖

2.5.4 主成分分析 為進一步比較不同批次除濕丸質量差異，將指紋圖譜中所得的35 個共有峰的相對峰面積導入SPSS 22.0 軟件中進行主成分分析，共7 個成分特征值＞1，具體數值分別為13.745、5.447、5.037、3.005、2.077、1.580、1.197，是影響除濕丸質量評價的主要因子；7 個主成分因子的累計方差貢獻率為89.133%，結果見表3。提示新變量綜合信息能力強，可以在損失較少信息的前提下，減少變量，達到降維目的。旋轉成分矩陣分析結果表明，第一主成分主要反映色譜峰6、7、10、21、23～27、35 的信息；第二主成分主要反映色譜峰5、7、8、14、15、17、24 的信息；第三主成分主要反映色譜峰1、4、9、11、12、14、19 的信息；第四主成分主要反映色譜峰19、20、22、28、33 的信息；第五主成分主要反映色譜峰30、32、34 的信息；第六主成分主要反映色譜峰31 的信息；第七主成分主要反映色譜峰13、18 的信息。

表3 特征值和累積貢獻率

3 討論

共有峰歸屬研究中發現除濕丸制劑中黃芩苷與黃芩素在黃芩飲片中占比不同。黃芩苷作為黃芩中主要的有效成分，其含量對藥效具有重要意義[21-23]。為防止黃芩素被水解，飲片加工廠通常會進行殺酶保苷，對黃芩殺酶保苷不徹底、硫熏等均會導致黃芩素的水解[24-27]。聚類分析結果可以明顯看出不同批次除濕丸樣品的分類與生產時間的相關性有密切關系，表明除濕丸的化學成分隨著儲存時間的長短在整體變化，需對其貯存的時間、溫度、濕度等條件進行進一步研究。指紋圖譜結合聚類分析、主成分分析等方法可全面評價除濕丸的質量，為除濕丸質量控制提供參考依據。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。