基于LC-MS/ MS 的鹿角方中紅景天苷在慢性心力衰竭大鼠心肌組織中的分布

時瀟麗 馬靜雅 劉 力

上海中醫藥大學附屬曙光醫院藥學部，上海 201203

紅景天苷屬于苯乙醇苷類化合物，是中藥女貞子的有效成分之一，具有抑制細胞凋亡、抗感染、抗氧化等多種藥理作用[1-2]；對缺血缺氧、力竭運動、化學品、生物毒素等引起的心臟損傷具有一定的心血管保護作用[3-5]。鹿角方來源于上海中醫藥大學附屬曙光醫院心內科胡婉英教授，其由鹿角膠、淫羊藿、女貞子、補骨脂、山茱萸、陳皮6 味藥材組成，已在臨床上安全使用20 余年，可補腎強心，改善慢性心力衰竭（以下簡稱“心衰”）的臨床癥狀、保護心臟功能[6-9]。紅景天苷原型藥物是大鼠體循環系統中的主要暴露物質[10]；前期對鹿角方入血成分分析中發現，紅景天苷是鹿角方在體內直接作用的主要物質之一[11]；但紅景天苷在心肌組織的分布尤其是在病理模型中心肌組織的分布尚未探索。據此，本研究旨在通過LC-MS/MS 法，對鹿角方中紅景天苷在慢性心衰大鼠心肌組織中的分布進行分析，以期為鹿角方的藥理作用機制研究及臨床用藥提供參考。

1 實驗對象

1.1 實驗動物

SPF 級Wistar 雄性大鼠45 只，6～8 周齡，180～220g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016，合格證號：2008001680211，動物使用許可證號：SYXK（滬）2014-0019。實驗動物在上海中醫藥大學動物實驗中心飼養，自由飲水、進食，溫度18～24 ℃，動物實驗方案經上海中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（SZY201707010）。

1.2 儀器與試劑

1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Triple-Quad 4500 質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；SECURA125-1CN 十萬分之一電子微量天平（德國Sartorius公司）；ME204E 萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；NDK200-2 氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）；VtexMixer VX200 型渦旋振蕩器（美國Labnet公司）；Legend micro 21R 高速離心機（美國Thermo Scientific 公司）；JXFSTPR-24 自動勻漿機（上海凈信科技有限公司）；SK7200B 超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

鹿角方浸膏粉（每克浸膏粉相當于5.13 g 生藥）由上海中醫藥大學附屬曙光醫院制劑實驗室制備。紅景天苷對照品（批號：110818-201507，含量99.4%）、地塞米松對照品（批號：100129-201506，含量99.8%）購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇（HPLC/MS 級）、乙腈（HPLC/MS 級）購于德國CNW。

2 方法與結果

2.1 對照品、內標及質控樣品溶液的配制

對照品溶液配制：取紅景天苷、地塞米松對照品適量，精密稱定，置于10 ml 棕色容量瓶，加入甲醇溶解并定容，配制對照品儲備液。取紅景天苷對照品儲備液適量，用50%甲醇水溶液逐級稀釋成38.240、76.480、152.960、764.800、1 529.600、7 648.000、15 296.000、38 240.000 ng/ml 標準溶液。

內標溶液配制：取地塞米松對照品儲備液適量，用50%甲醇水溶液稀釋成50.000 ng/ml。

質控樣品配制：取紅景天苷對照品儲備液適量，配制成低（2.390 ng/ml）、中（47.800 ng/ml）、高（956.000 ng/ml）3 種濃度的心肌組織勻漿液質控樣品。

2.2 色譜及質譜條件

色譜條件：Phenomenex Luna-C18色譜柱（2.0 mm×100 mm，5 μm），流動相A 為水，流動相C 為乙腈，洗針液為50%甲醇水溶液，采用梯度洗脫[12]。洗脫條件：0.0～0.2 min，5%C；0.2～1.5 min，5%→20%C；1.5～5.0 min，20%→70%C；5.0～6.0 min，70%→90%C；6.0～8.0 min，90%C；8.0～8.1 min，90%→5%C；8.1～11.1 min，5%C。流速0.8 ml/min，柱溫40 ℃，樣品室溫度4 ℃，進樣量10 μl。

質譜條件：采用電噴霧離子源，多反應監測模式檢測，負離子模式檢測；氣簾氣為25.0 psi，碰撞氣為9.0 psi，粒子噴霧電壓為-4.5 kV，離子源溫度為550 ℃，霧化氣為55 psi，輔助氣為55 psi[12]。紅景天苷m/z 299.1→118.1，地塞米松m/z 437.2→361.2。

2.3 慢性心衰大鼠模型建立與動物分組

45 只大鼠按簡單隨機抽樣法選取8 只作為假手術組，其余大鼠行腹主動脈縮窄手術進行慢性心衰大鼠模型的構建[13-14]。大鼠術前禁食，腹腔麻醉，仰臥位固定，于劍突下0.5 cm 沿腹中線打開腹腔，切口約1.5 cm，撥開腸道，鈍性分離左、右腎動脈之間腹主動脈，在離左腎動脈開口上緣0.5 cm 處將自制L 型鈍頭不銹鋼針（外徑0.6 mm）與腹主動脈結扎，立即抽離不銹鋼針，結扎處見明顯窄縮，縫合切口。術后保溫，肌肉注射青霉素，連續3 d。假手術組開腹暴露腹主動脈，不結扎，其余同模型組。

術后4 周將存活的32 只模型大鼠按體重進行區組隨機分組：模型組、鹿角方低劑量組（1.100 g/kg）、鹿角方中劑量組（2.200 g/kg，臨床等效劑量）、鹿角方高劑量組（4.400 g/kg），每組8 只。

2.4 給藥方案與心肌組織樣品的采集

假手術組、模型組大鼠給予純水，鹿角方低、中、高劑量分別由鹿角方浸膏粉加純水配制成0.160、0.315、0.640 g/ml 的混懸液，各組大鼠給藥容量均為7 ml/kg，1 次/d，連續30 周。末次灌胃給藥2 h 后麻醉大鼠，腹主動脈取血，采集心臟，生理鹽水清洗殘留血液后，立即分離左心室及右心室壁，液氮立即凍存，-80 ℃保存備用。

2.5 心肌組織樣品預處理方法

將大鼠心肌組織從-80 ℃冰箱中取出，冰浴下解凍，取適量組織剪碎，精密稱定，加入4 倍量預先冰浴的超純水，于冰浴下勻漿。前處理過程參考文獻[12]，具體如下：精密吸取300 μl 勻漿液，加入10 μl 內標溶液，渦旋震蕩1 min，加入4 倍量預先冰浴的乙腈沉淀蛋白，渦旋震蕩1 min，10 000 r/min，4 ℃離心10 min（離心半徑：86 mm）。取上清液于常溫下氮吹干，精密加入150 μl 50%甲醇水溶液復溶，渦旋震蕩2 min，10 000 r/min 低溫離心10 min，取上清液進行LC-MS/MS分析。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性、定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）考察 精密吸取空白大鼠心肌組織勻漿液300 μl，除不加入紅景天苷對照品和內標溶液外，其他按照“2.5”項下方法操作、“2.2”項下條件分析，得到大鼠空白心勻漿液的色譜圖；配制LLOQ 心肌組織勻漿樣品，依同法處理，得相應標準樣品色譜圖。紅景天苷的保留時間為2.66 min，在該方法處理下大鼠心肌組織勻漿液中內源物質在相應出峰時間不干擾樣品的測定，化合物峰形良好（圖1）；LLOQ 為1.195 ng/ml，滿足信噪比（S/N≥10）。

圖1 心肌組織勻漿液色譜圖

2.6.2 線性關系考察 精密吸取大鼠空白心肌組織勻漿液300 μl，分別精密加入“2.1”項下不同濃度的紅景天苷對照品溶液10 μl，加入10 μl 內標溶液，渦旋混勻1 min，配制成含紅景天苷濃度為1.195、2.390、4.780、23.900、47.800、239.000、478.000、1 195.000 ng/ml的心肌組織勻漿液，按“2.5”項下方法操作、“2.2”項下條件分析，以紅景天苷濃度為橫坐標，待測物與內標物峰面積比值為縱坐標，作加權線性回歸計算。紅景天苷在1.195～1 195.000 ng/ml 范圍內線性關系良好（r＞0.999）。

2.6.3 精密度與準確度試驗LLOQ 及低、中、高濃度的心肌組織勻漿液質控樣品，加入10 μl 內標溶液，每個濃度平行6 份，連續配制與平行測定3 d，根據標準曲線計算樣品濃度。準確度為測定濃度與標稱濃度的相對偏差（relative error，RE）的平均值，精密度為測定濃度的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。低、中、高濃度質控樣品中紅景天苷精密度RSD%均＜15%，準確度為90.817%～106.500%（表1）。

表1 方法精密度與準確度結果（n=6）

2.6.4 回收率與基質效應實驗 低、中、高濃度心肌組織勻漿液質控樣品，加入10 μl 內標溶液，按“2.5”項下操作、“2.2”項下條件分析，計算紅景天苷與內標峰面積比值（A）；相應低、中、高濃度對照品溶液10 μl和內標溶液10 μl，加入經按“2.5”項下操作至氮吹后的空白血漿基質中，再加入50%甲醇水溶液（130 μl）復溶，分析得紅景天苷與內標峰面積比值（B）；平行配置成如上相應濃度的對照樣品標準溶液進行分析，分析得紅景天苷與內標峰面積比值（C）。以上3 種配制方法每個濃度平行操作6 份。參考《藥物分析（第八版）》[15]體內樣品分析方法驗證，相對回收率=A/B×100%，基質效應=B/C×100%。質控樣品中紅景天苷的相對回收率為95.222%～100.814%，基質效應RSD%均＜15%（表2）。

表2 紅景天苷在心肌組織樣品中的相對回收率及基質效應（n=6）

2.6.5 穩定性實驗 低、中、高濃度心肌組織勻漿液質控樣品，加入內標溶液10 μl。分別考察樣品冰浴放置1 h、前處理后在室溫放置6 h、自動進樣器（4℃）放置24 h 和48 h 的穩定性，每個濃度平行操作6 份。結果顯示，紅景天苷在上述條件下的穩定性良好（表3）。

表3 穩定性結果（，n=6）

表3 穩定性結果（，n=6）

2.7 紅景天苷在大鼠心肌組織中的分布

紅景天苷在左、右心室壁的含量隨給藥劑量的增加而升高，采用線性擬合方法分析紅景天苷含量與給藥劑量的關系，其中紅景天苷在右心室壁含量與給藥劑量線性擬合值R2為0.983（圖2）。中、高劑量鹿角方組中紅景天苷在左心室壁的含量為右心室壁含量的（47.383±12.156）%、（43.805±9.644）%，紅景天苷在慢性心衰大鼠心臟左、右心室的分布不同（表4）。

表4 鹿角方中紅景天苷在大鼠左、右心室壁中的含量（）

表4 鹿角方中紅景天苷在大鼠左、右心室壁中的含量（）

注-：未對樣品分析。LLOQ：定量下限。

圖2 紅景天在慢性心衰大鼠右心室的含量與給藥劑量的線性關系

3 討論

病理狀態下，病變的組織器官可能影響藥物的分布行為[16]。本研究發現，紅景天苷在模型大鼠心臟左、右心室壁的分布存在差異。腹主動脈縮窄法是慢性心衰動物模型的常用方法之一，其可引起大鼠壓力負荷型左心室心肌肥厚[17]；而長期后負荷過重最終造成心臟功能失代償形成心衰[18]。過度肥大的心肌具有不平衡生長的特性，即心肌細胞體積的增長超過血管的生長，導致毛細血管分布的密度相對下降，造成不同程度的缺血、缺氧。因此，模型大鼠左心室肥厚區單位面積血流量是下降的，前期研究結果可知該模型造成的左心室心肌肥厚病理改變明顯大于右心室，推測上述是造成紅景天苷在左、右心室分布不同的原因[12]。

生物樣品前處理是藥動學研究過程中的關鍵步驟[19]。某些分析物在前處理中易受生物樣品中的酶、環境溫度、pH 值等因素影響而發生降解，導致藥物在組織中的含量被低估[20]。分析物的穩定性是體內藥物分析結果準確和可重復的重要因素，通常應考察質控樣品從冰箱儲存條件到室溫或樣品處理溫度的穩定性及前處理環境（通常為室溫）短期放置的穩定性[21-24]。在前期質控樣品3 次反復凍融（-80℃→室溫）穩定性及室溫2、6 h 穩定性的預實驗考察中發現，紅景天苷含量降低，且樣品中的紅景天苷在室溫放置時間越長含量下降越多，經質譜分析為紅景天苷向其降解產物酪醇轉化，基于純水及空白基質對紅景天苷含量無明顯影響，結合文獻推測組織勻漿液中所含酶可能是紅景天降解的原因之一[12，25]。在本研究中考察了樣品冰浴放置1 h 穩定性，結果顯示穩定性符合要求。提示將樣品置于冰浴環境并縮短前處理放置時間，可改善樣品室溫放置中紅景天苷的降解現象，該現象可能與低溫下酶的活性被抑制，紅景天苷被酶解的速度降低有關。總之，為了保證檢測數據的準確性，心肌組織取樣后應立即分離后液氮快速凍存，以抑制酶的活性，分析時樣品組織勻漿后應在冰浴下盡快處理（1 h內），不應進行反復凍融。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。