九節茶藥材質量標準研究

蘇銳輝，于小慶，江濤*，湯迎湛，彭紅英，李怡芳，何蓉蓉（.廣州白云山敬修堂藥業股份有限公司，廣州 5030；.暨南大學 藥學院，廣州 5063）

九節茶為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥地上部分，作為清熱消炎寧膠囊的主要原料，具有清熱解毒、涼血、消斑、祛風除濕、通絡止痛的功效[1]。九節茶主要化學成分有倍半萜、倍半萜二聚體、倍半萜三聚體[2]、香豆素[3-4]、黃酮類[4]和酚酸類[5]，具有抗炎[6-9]、抗腫瘤[10-12]、抗菌[3-4，13]、抗氧化[14]等多種活性。九節茶具有悠久的使用歷史，主要產于福建、廣東、廣西和江西等省區[15]。

九節茶現行質量標準收載于《廣東省中藥材標準第一冊》（2004年版），檢測項目僅包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、含量測定，尚未對水分、浸出物等項目進行考察。薄層鑒別采用甲苯展開系統，毒性較大，而且氨熏顯色后，異嗪皮啶特征斑點顯色不明顯，不利于結果判斷。含量測定項中供試品溶液的制備需要長時間靜置，同時使用毒性較大的三氯甲烷作為溶劑。為了完善九節茶藥材質量標準，更好地控制九節茶質量，本研究對九節茶質量檢測方法進行了探索，同時對影響九節茶質量的因素進行研究，旨在為九節茶采收加工提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XA105十萬分之一電子天平、ME204T萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；薄層色譜數碼成像系統[瑞士CAMAG（卡瑪）公司]。

1.2 試藥

九節茶對照藥材（批號：121756-202001）、異嗪皮啶對照品（批號：110837-202009，含量以99.8%計）、迷迭香酸對照品（批號：111871-202007，含量以98.1%計）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈為色譜純；甲醇、乙醇為分析純。13批九節茶藥材經中國科學院華南植物園華南植物鑒定中心葉華谷研究員鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandraglabra（Thunb.）Nakai的干燥地上部分，具體信息見表1。

表1 九節茶藥材信息Tab 1 Information of Sarcandra glabra samples

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

取九節茶粉末約1 g，加水50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液加乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取九節茶對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。另取異嗪皮啶對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。參照《中國藥典》（2020年版）四部通則0502，吸取上述3種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶6∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。再噴以2%三氯化鐵溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，見圖1。

圖1 九節茶藥材365 nm下（A）及日光下（B）薄層鑒別圖Fig 1 TLC chromatograms of Sarcandra glabra samples in 365 nm（A）and day light（B）

2.2 檢查

2.2.1 水分 照《中國藥典》（2020年版）四部通則0832第二法測定，13批藥材的水分為6.5%～12.6%，平均為9.4%，結果見表2。

表2 九節茶藥材水分、灰分和浸出物測定Tab 2 Moisture，total ash，acid-insoluble ash and extract of Sarcandra glabra samples

2.2.2 總灰分及酸不溶性灰分 照《中國藥典》（2020年版）四部通則2302測定，13批藥材的總灰分為4.1%～7.1%，平均為5.2%；酸不溶性灰分為0.1%～1.5%，平均為0.5%。結果見表2。

2.2.3 浸出物 照《中國藥典》（2020年版）四部通則2201項下的熱浸法測定，13批藥材的水溶性浸出物為7.3%～22.9%，平均為12.6%，結果見表2。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）為流動相；檢測波長為342 nm，進樣量為10 μL；柱溫為25℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 取異嗪皮啶、迷迭香酸對照品各適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL各含10 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取九節茶粉末約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min（功率360 W，頻率40 kHz），放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 系統適用性試驗 取對照品溶液和供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，異嗪皮啶及迷迭香酸與其相鄰色譜峰分離度均大于1.5，理論板數均在5000以上，色譜圖見圖2。

圖2 對照品溶液（A）和供試品溶液（B）HPLC圖Fig 2 HPLC chromatograms of reference solution（A）and sample solution（B）

2.3.5 線性關系考察 取異嗪皮啶、迷迭香酸對照品制成不同濃度混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，依法測定。以峰面積為縱坐標，對照品含量為橫坐標，繪制標準曲線，計算異嗪皮啶和迷迭香酸回歸方程分別為Y1＝2958.90X1-0.09（r＝0.9999），Y2＝2509.72X2-7.99（r＝0.9999），線性范圍分別為0.0160～0.3203 μg、0.0157～1.5672 μg。

2.3.6 方法學考察

① 檢測限及定量限試驗：取異嗪皮啶、迷迭香酸對照品各適量，加甲醇溶解，逐級稀釋，進樣測定。按信噪比（S/N）約為3∶1計算，異嗪皮啶檢測限為0.5 ng，迷迭香酸檢測限為1.5 ng；按S/N約為10∶1計算，異嗪皮啶定量限為2.0 ng，迷迭香酸定量限為5.2 ng。

② 精密度試驗：取九節茶供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣，測定6次，計算異嗪皮啶和迷迭香酸峰面積RSD分別為0.31%、0.58%，說明儀器精密度良好。

③ 重復性試驗：取S11批九節茶按“2.3.3”項下方法制備6份供試品溶液，進樣測定，計算異嗪皮啶平均含量為0.025%，RSD為1.5%；迷迭香酸平均含量為0.028%，RSD為0.50%，說明檢測方法重復性良好。

④ 穩定性和耐用性試驗：取九節茶供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、16、24 h進樣測定，計算異嗪皮啶和迷迭香酸峰面積RSD分別為1.5%、0.28%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好；取同一供試品溶液分別采用3根不同品牌的十八烷基硅烷鍵合硅膠填充色譜柱進樣測定，異嗪皮啶含量RSD為2.3%，迷迭香酸含量RSD為2.6%，說明檢測方法耐用性良好。

⑤ 準確度試驗：取異嗪皮啶對照品、迷迭香酸對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL各含2 μg的溶液。取已知異嗪皮啶和迷迭香酸含量的九節茶6份（批號：S11），各約0.2 g，精密加入上述對照品溶液25 mL，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算異嗪皮啶和迷迭香酸的加樣回收率分別為99.63%～101.35%、96.91%～98.73%，RSD分別為0.59%、0.75%，說明檢測方法準確度良好。

2.3.7 樣品含量考察 取九節茶樣品適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，按干燥品計算樣品中異嗪皮啶和迷迭香酸的含量，結果見表3。

表3 九節茶藥材異嗪皮啶和迷迭香酸含量測定結果(n＝3)Tab 3 Contents of isofraxidin and rosmarinic acid in Sarcandra glabra samples (n＝3)

2.4 結果分析

2.4.1 不同生長年限對九節茶質量的影響 選取同一種植基地不同生長年限的九節茶藥材進行對比，S9、S11、S12生長年限分別為一年、兩年、三年。結果顯示不同生長年限九節茶藥材水溶性浸出物含量接近，異嗪皮啶和迷迭香酸含量存在差異。一年生九節茶藥材異嗪皮啶和迷迭香酸含量較低，兩年生九節茶異嗪皮啶和迷迭香酸含量明顯增加，三年生九節茶藥材含量趨于穩定。

2.4.2 不同干燥條件對九節茶質量的影響 采用曬干及30、50、70℃鼓風干燥4種不同干燥條件處理同一批兩年生九節茶藥材，干燥后九節茶水分為9.97%～11.56%。比較不同干燥條件下九節茶異嗪皮啶和迷迭香酸含量：70℃烘干時，迷迭香酸含量下降明顯；曬干、30℃及50℃烘干時，異嗪皮啶和迷迭香酸含量接近。綜合考慮干燥時長、操作難度和九節茶特征成分含量，50℃鼓風干燥更適合九節茶大規模加工生產，結果見表4。

表4 不同干燥條件對九節茶質量的影響Tab 4 Contents of isofraxidin and rosmarinic acid in Sarcandra glabra with different drying methods

3 討論

3.1 考察指標的選擇

九節茶現行質量標準以異嗪皮啶為含量測定指標成分，異嗪皮啶屬于香豆素類化合物，是九節茶抗炎的主要活性成分[6]。迷迭香酸為酚酸類化合物，具有抗炎[8]、抗腫瘤[10]等作用。異嗪皮啶及迷迭香酸最大紫外吸收波長接近，在液相色譜上能實現同時測定。結合液相色譜分析，九節茶中異嗪皮啶和迷迭香酸含量均較高，因此選擇異嗪皮啶和迷迭香酸作為含量測定指標。

3.2 薄層鑒別方法考察

本研究采用不同濃度甲醇溶液和乙醇溶液制備供試品溶液，均未能取得良好的鑒別效果。另外，本研究對展開劑（二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸、正己烷-乙酸甲酯-甲酸、環己烷-乙酸乙酯-冰醋酸）、顯色劑（氨熏、硫酸乙醇溶液、三氯化鐵溶液）、薄層板廠家（青島海洋化工有限公司、德國Merck公司）、點樣量（2、4、6 μL）進行了考察，最終確定了本文的鑒別方法。

3.3 限量標準建議

13批九節茶樣品的水分為6.5%～12.6%，由于九節茶主要種植在南方林下，濕度較大，建議水分不得高于15.0%；總灰分為4.1%～7.1%，建議總灰分不得高于8.0%；酸不溶性灰分為0.1%～1.5%，考慮不同樣品間酸不溶性灰分差異較大，建議酸不溶性灰分不得高于2.0%；浸出物為7.3%～22.9%，建議浸出物不得少于7%；異嗪皮啶含量為0.006%～0.046%，迷迭香酸含量為0.002%～0.081%，建議含量按干燥品計算，含異嗪皮啶不得少于0.02%，含迷迭香酸不得少于0.02%。

4 結論

本研究對九節茶藥材質量檢測方法進行了研究，改善了其薄層鑒別方法，同時以異嗪皮啶和迷迭香酸為對照品建立了含量測定方法。研究共收集13批九節茶藥材進行分析，初步建立了九節茶藥材質量標準，有效地評價了九節茶藥材的質量。通過分析生長年限和干燥條件對九節茶藥材質量的影響，為九節茶藥材的采收加工提供依據。