靜脈注射吳茱萸堿-甘草酸納米膠束后吳茱萸堿在大鼠體內藥代動力學研究

鄧英光，銀雪艷，郭秀彩，張紫萍，李峰（廣州市第十二人民醫院，廣州 510620）

吳茱萸堿（evodiamine，EVO）是蕓香科植物吳茱萸、石虎和疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實中的色胺吲哚類生物堿成分[1-2]，具有抗炎、抗纖維化、抗脂毒性、抗腫瘤活性[3]，但EVO存在水溶性差，代謝過快，靶向性差等缺點[4-5]，使其臨床應用受到限制。甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）所具有的兩親性結構特點使其對難溶性藥物具有增溶作用，大量研究表明以甘草酸作為載體的新型藥物，其藥物溶解度和生物利用度均有明顯的提高[6]，甘草酸作為天然藥物活性成分，已被證實是安全無毒的生物材料，在一定條件下不會導致溶血[7]，符合國家靜脈注射的標準，因此甘草酸可以滿足作為有前景的藥物遞送載體的靜脈藥物開發的基本要求。前期我們以甘草酸作為載體對EVO進行包封，采用薄膜分散法制備出吳茱萸堿-甘草酸納米膠束[（EVOGL）-micelles]，制備成膠束后EVO的溶解度明顯增加[8]，可作為靜脈注射藥物。為進一步了解（EVOGL）-micelles在大鼠體內的藥代動力學過程，尾靜脈分別注射EVO和（EVO-GL）-micelles后，采用HPLC測定大鼠血漿中EVO含量，評價膠束對EVO藥代動力學的影響，以期為EVO新型給藥系統提供依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A島津高效液相色譜儀（日本島津有限公司）；Quintix65-1CN電子天平（德國賽多利斯公司）；5804R Eppendorf冷凍離心機（美國艾本德公司）；減壓真空干燥箱（上海高致精密儀器有限公司）。

1.2 試藥

EVO（純度＞98%，批號：C16244049，Aladdin），EVO對照品（純度＞99%，Aladdin，批號：A1629030），甘草酸（純度＞98%，北京百靈威科技有限公司，批號：LS40R62），乙腈、甲醇（色譜級，德國Merck公司），乙醇等其他試劑為分析純，水為超純水。

1.3 動物

雄性SD大鼠，200～220 g[南方醫科大學南方醫院實驗動物中心，動物使用許可證，SYXK（粵）2015-0056；合格證號：44002100013124]。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

所用色譜柱為Ecosil C18反相液相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40℃；流動相為乙腈-水＝60∶40；流速1.0 mL·min-1；檢測波長225 nm；檢測器為二極管陣列紫外可見光檢測器（SPD-M20A）；進樣量20 μL；分析時間7 min。

2.2 溶液的制備

精密稱量10 mg EVO對照品，用甲醇溶解后轉移至50 mL棕色量瓶，加入甲醇定容至50 mL，即得到200 μg·mL-1的EVO對照品儲備液。精密吸取適量EVO對照品儲備液，使用適量的甲醇稀釋制成質量濃度為100、500、2000 ng·mL-1作為EVO對照品溶液。

2.3 動物給藥方案及樣品采集處理

將12只雄性SD大鼠隨機平均分成（EVO-GL）-micelles組和EVO溶液組[用復合溶劑（5% DMSO，10%吐溫80，85% 0.9%氯化鈉溶液）超聲溶解[9]]。給藥前稱量大鼠體重，按 3 mg·kg-1（以EVO計）的劑量分別尾靜脈注射EVO溶液和（EVO-GL）-micelles。給藥后分別于0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h進行眼底取血，置于肝素化離心管，4℃、3500 r·min-1離心10 min，吸取上層血漿到離心管，于-20℃保存備用。

2.4 樣品的處理

取100 μL血漿樣品，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋混合3 min，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，50℃真空干燥揮干有機溶劑，加入100 μL甲醇復溶，渦旋3 min，12 000 r·min-1離心15 min。取上清液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性 記錄EVO對照品、空白血漿樣品、空白血漿＋EVO對照品溶液、靜脈（EVOGL）-micelles給藥后30 min血漿樣品的HPLC圖，結果如圖1所示，血漿樣品中的內源物質不干擾EVO的色譜峰，EVO出峰時間短，保留時間為4.7 min，峰形良好。

圖1 吳茱萸堿-甘草酸納米膠束的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of（EVO-GL）-micelles

2.5.2 標準曲線以及定量下限 空白血漿中加入不同濃度的EVO溶液，即得到含EVO質量濃度分別為25、50、100、250、500、1000、2000、4000 ng·mL-1的標準血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理血漿樣品。按“2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積。以藥物質量濃度（μg·mL-1，c）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標進行回歸擬合標準曲線，得到EVO的標準曲線方程：A＝2.624×105c＋2.234×104（r＝0.998）。結果顯示血漿樣品中的EVO在25～4000 ng·mL-1與峰面積線性關系良好。根據信噪比（S/N）＝10的原則，確定定量下限為25 ng·mL-1。

2.5.3 精密度 分別吸取100 μL空白血漿，制備低、中、高3個EVO質量濃度（100、500、2000 ng·mL-1）的血漿樣品，每個濃度準備5份，按照“2.4”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積。在同一天內每個濃度各測定3次，考察日內精密度；連續測定3 d，考察日間精密度。結果日內精密度RSD為4.5%～5.1%，日間精密度RSD為5.3%～8.5%，達到生物樣品分析要求。

2.5.4 提取回收率 分別吸取100 μL空白血漿，制備低、中、高3個EVO質量濃度（100、500、2000 ng·mL-1）的血漿樣品各5份，分別按照“2.4”方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。通過標準曲線計算EVO的濃度，提取回收率（%）＝提取后實測EVO濃度/理論濃度×100%。得出3個濃度EVO提取回收率為95.3%～98.4%，RSD范圍為5.7%～8.1%。達到生物樣品分析要求。

2.5.5 藥代動力學實驗數據處理及結果 數據處理后，得大鼠靜脈注射后各時間點EVO的平均血藥濃度，大鼠尾靜脈給藥 EVO和（EVO-GL）-micelles后吳茱萸堿的藥物濃度-時間曲線見圖2。使DAS 2.0軟件用對血藥濃度和時間采用靜脈給藥模型擬合，得到藥代動力學參數見表1。數據顯示EVO組在體內符合二室模型，（EVO-GL）-micelles組符合三室模型。（EVO-GL）-micelles組的Cmax明顯高于EVO組（P＜0.05）。（EVO-GL）-micelles組的AUC0～t是EVO組的2.30倍。（EVO-GL）-micelles組清除率（CL）較EVO組明顯降低（P＜0.05）。

表1 EVO和(EVO-GL)-micelles的藥代動力學參數(±s，n＝6)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of EVO and (EVO-GL)-micelles(±s，n＝6)

表1 EVO和(EVO-GL)-micelles的藥代動力學參數(±s，n＝6)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of EVO and (EVO-GL)-micelles(±s，n＝6)

注：與EVO組相比，*P＜0.05。Note：Compared with the EVO group，* P＜0.05.

參數（EVO-GL）-micellesEVO Cmax/（μg·mL-1）1.61±0.19*0.92±0.11 t1/2/h3.66±1.493.26±0.59 V1/（L·kg-1）1.91±0.20*3.42±0.48 CL/（L·h-1·kg-1）0.67±0.21*1.38±0.14 AUC0～t/（mg·L-1·h）4.76±1.41*2.07±0.22 AUC0～∞/（mg·L-1·h）4.88±1.47*2.19±0.22

圖2 大鼠尾靜脈給藥 EVO和（EVO-GL）-micelles后吳茱萸堿的藥物濃度-時間曲線（±s，n＝6）Fig 2 Plasma concentration-time profile of evodiamine after tail vein administration of EVO and（EVO-GL）-micelles in rats（±s，n＝6）

3 討論

本實驗建立了HPLC法測定大鼠血漿中EVO含量，對（EVO-GL）-micelles和EVO進行了藥代動力學評價，結果顯示，EVO制備成（EVO-GL）-micelles納米膠束后，（EVO-GL）-micelles組的AUC0～t是原藥EVO的2.30倍，CL是原藥EVO的0.48倍，說明制備成（EVO-GL）-micelles納米膠束后，EVO在體內的血漿清除率降低，表明（EVOGL）-micelles組相比EVO原藥在大鼠體內具有更好的緩釋性，明顯改善了EVO的藥代動力學過程，提高EVO在血液中的濃度和滯留時間。前期我們體外釋藥實驗證明（EVO-GL）-micelles累計釋放量明顯高于EVO原藥，膠束中EVO 釋放緩慢，可能是由于藥物主要包載于膠束疏水性內核中，以膠束的形式存在，從而起到緩釋作用[8]。同時可能與制備成甘草酸膠束后的靶向作用有關，甘草酸具有皂苷類兩親性物質結構特點，使其能夠結合細胞膜上的膽固醇或磷脂，改變細胞膜上脂質的流動性，誘導細胞膜孔隙的形成，細胞膜通透性明顯增加，膠束與細胞膜相互作用，釋放大量的皂苷，從而在病變部位可達到高濃度的累積，甘草酸的直接跨膜遞送機制可能影響了EVO的代謝，從而起到緩釋的作用[10-11]。DAS 2.0擬合數據顯示EVO組符合二室模型，（EVO-GL）-micelles組更符合三室模型，可能在組織分布上與EVO組存在差異，體內正常器官如肝臟中肝細胞膜上有甘草酸和甘草次酸的結合位點，有研究發現靜脈注射甘草酸后，甘草酸快速被肝臟攝取及蓄積，由甘草酸修飾后的藥物具有明顯的肝靶向性[7]，可用于肝臟疾病的治療，利用甘草酸的直接跨膜遞送機制及顯著的肝靶向性能力，用于構建作用于肝纖維化組織的靶向藥物具有良好的應用前景，需要進一步研究。