基于GC-TOF-MS和UHPLC-QE-MS的蘇合香化學成分分析

牟菲，張倩，藺瑞，趙美娜，陶星茹，趙瑾怡，湯海峰，王婧雯*（.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 7003；.空軍軍醫(yī)大學藥學系，西安 7003）

蘇合香（styrax；storax；Suhexiang）是從金縷梅科植物蘇合香樹（LiquidambarorientalisMill.）的樹干滲出并精制而成的一種香樹脂，具有“溫通心脈”之功效，相關(guān)方劑治療冠心病臨床療效確切、應(yīng)用廣泛[1-4]。蘇合香作為樹脂和油狀液體混合物，化學成分十分復雜，目前僅靠單一指標性成分鑒定很難全面反映蘇合香的內(nèi)在質(zhì)量差異。因此，全面分析蘇合香化學成分對于蘇合香藥效物質(zhì)的篩選及其二次開發(fā)具有重要意義。

中藥多維度數(shù)據(jù)的分析和利用成為新的掣肘問題，質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其高分辨率、高分離性和高靈敏度等優(yōu)勢著稱，使用該技術(shù)，無需參照標準物質(zhì)，即可精確地表征中藥中含有的化合物的結(jié)構(gòu)，包括精確質(zhì)量數(shù)、元素組成和質(zhì)譜碎片信息等，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于中藥化學成分鑒定[5-7]。因此，本研究首次采用GC-TOF-MS結(jié)合UHPLC-QE-MS的分析方法對蘇合香化學成分進行初步定性分析，以期為蘇合香防治疾病的藥效物質(zhì)篩選提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B氣相色譜-LECO PEGASUS HT質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)（Agilent）； Vanquish UHPLC-Q Exactive HFX質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng)（Thermo）；渦旋儀（江蘇其林貝爾公司）；超純水機（德國默克密理博Milli-Q）；電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

肉桂酸肉桂酯、4-羥基肉桂酸對照品（上海易恩化學技術(shù)有限公司），肉桂酸芐酯、肉桂醛對照品（北京百靈威科技有限公司），肉桂酸對照品（中國食品藥品檢定研究院），上述對照品批號分別為R020240、R006198、JK508307、JK188151、110786，含量均大于 98%，均于 4℃冷藏備用。

色譜純甲醇和乙腈（德國CNW Technologies公司）、色譜純乙酸銨（美國Sigma-Aldrich公司）、乙酸（美國Fisher Chemical公司）、超純水（電阻率為18.25 MΩ）由超純水機系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-TOF-MS法測定蘇合香揮發(fā)性成分

2.1.1 供試品溶液制備 精密稱取蘇合香提取物1 g置5 mL EP管中，并加入3 mL預(yù)冷甲醇冰水浴超聲10 min，靜置后將供試品溶液4℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液置進樣瓶中待測。

2.1.2 檢測條件 Agilent 7890B氣相色譜-LECO PEGASUS HT質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，毛細管柱為Agilent DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，USA），GC-TOF-MS具體參數(shù)設(shè)置見表1。

表1 GC-TOF-MS上機檢測參數(shù)設(shè)定Tab 1 Detection parameter of GC-TOF-MS

2.1.3 數(shù)據(jù)分析 使用LECO公司的Chroma TOF工作站軟件（Version 4.3x）和NIST數(shù)據(jù)庫（https：//www.nist.gov/index.html）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊、質(zhì)譜匹配等分析確定蘇合香中的化學成分，并通過面積歸一化法計算各化學成分在蘇合香中的相對百分含量。

2.1.4 成分識別 采用GC-TOF-MS質(zhì)譜聯(lián)用儀進行分離分析，得到蘇合香成分質(zhì)譜總離子流圖，如圖1所示。以面積歸一化法測定各成分相對百分含量，經(jīng)Chroma TOF軟件和NIST庫對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索對比，并結(jié)合標準質(zhì)譜圖鑒定化學成分，按照目標物與標準物的相似度達 80%，初步鑒定出蘇合香提取物中 25個揮發(fā)性成分，占蘇合香提取物色譜峰總面積的97.7%，主要成分有肉桂酸肉桂酯（29.46%）、肉桂醇（11.17%）、肉桂酸芐酯（8.83%）、苯甲酸肉桂酯（6.69%）、β-石竹烯（2.47%）、肉桂醛（2.02%）和苯乙烯（0.77%）等，具體成分及其相對含量結(jié)果如表2所示。

圖1 蘇合香 GC-TOF-MS 總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of styrax based on GC-TOF-MS

表2 蘇合香的揮發(fā)性成分及其相對含量Tab 2 Volatile components of styrax and their relative mass fractions

2.2 UHPLC-QE-MS法測定蘇合香可溶性成分

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱取蘇合香提取物1 g，加入3 mL甲醇，過0.45 μm濾膜，樣品稀釋至50 mg·mL-1上機檢測；每個對照品稱取10 mg，用甲醇定容到1 mL，得到10 mg·mL-1對照品溶液，過0.45 μm濾膜后取等體積混合，混標稀釋1000倍上機檢測。

2.2.2 檢測條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；質(zhì)譜儀為Thermo Q Exactive HFX，一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為Xcalibur（Thermo Fisher Scientific，USA）；UHPLC-QE-MS具體參數(shù)設(shè)置見表3。

表3 UHPLC-QE-MS上機檢測參數(shù)設(shè)定Tab 3 Detection parameter of UHPLC-QE-MS

2.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用ProteoWizard軟件，將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML格式后，然后進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，將收集到的蘇合香的化合物名稱、分子式、加合離子、m/z值、一級和二級質(zhì)譜碎片等信息，導入自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。MS2score為二級質(zhì)譜匹配定性打分值，取值范圍為0～1，越接近于1，代表匹配結(jié)果可信度越高。對于有對照品的化合物，將此化合物與對照品的色譜保留時間tR和一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進一步比對確認。對于無對照品的化合物，隨后將得到的色譜圖用 TOPPView軟件打開，根據(jù)tR分析二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與METLIN（https：//metlin.scripps.edu）和 HMDB數(shù)據(jù)庫中的二級碎片信息比對推斷性地鑒定化合物。

2.2.4 成分識別 為蘇合香在正離子和負離子模式下的UHPLC-QE-MS總離子流圖見圖2。結(jié)合一級、二級質(zhì)譜信息、對照品信息，以及與METLIN 和 HMDB數(shù)據(jù)庫中的二級碎片信息比對推斷，初步鑒定出蘇合香中的32個化學成分，即正離子模式下19個，負離子模式下13個，具體識別出的蘇合香主要化學成分信息見表4和表5。

圖2 蘇合香 UHPLC-QE-MS 的總離子流圖Fig 2 Total ion chromatogram of styrax based on UHPLC-QE-MS.

表4 正離子模式下蘇合香 UHPLC-QE-MS 檢測化學物質(zhì)成分表征Tab 4 Identification of chemical components in styrax by UHPLC-QE-MS in positive ion mode

表5 負離子模式下蘇合香 UHPLC-QE-MS 檢測化學物質(zhì)成分表征Tab 5 Identification of chemical components in styrax by UHPLC-QE-MS in negative ion mode

2.2.5 質(zhì)譜解析舉例 根據(jù)二級離子質(zhì)譜裂解碎片與數(shù)據(jù)庫或?qū)φ掌穼Ρ龋Y(jié)合相關(guān)文獻分析。識別出的化合物詳細的MS/MS 數(shù)據(jù)見表4和表5。本試驗以肉桂酸肉桂酯、肉桂酸芐酯、苯甲酸為例來闡明裂解途徑。

肉桂酸肉桂酯的裂解途徑見圖3，在正離子模式下得到準分子離子m/z265.1223 [M＋H]＋，它在很小的碰撞能量下易發(fā)生酯鍵斷裂，得到碎片離子m/z131.0489；繼而失去CO分子，得到m/z103.0541碎片離子；m/z103.0541碎片離子發(fā)生斷裂，脫掉側(cè)鏈CH生成豐度較高的碎片離子m/z91.0540；經(jīng)過正離子裂解途徑分析，可確證該物質(zhì)為肉桂酸肉桂酯。

圖3 正離子下肉桂酸肉桂酯二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig 3 MS2 spectrum and fragmentation pathways of cinnamyl cinnamate in positive ion mode

肉桂酸芐酯的裂解途徑見圖4，在正離子模式下得到準分子離子m/z239.1067 [M＋H]＋，與肉桂酸肉桂酯相似，它可以在極低能量下發(fā)生酯鍵斷裂，得到碎片離子m/z131.0487；再次失去CO分子，得到碎片離子m/z103.0541；m/z103.0541碎片離子發(fā)生斷裂后繼續(xù)脫掉CH產(chǎn)生碎片離子m/z91.0540；經(jīng)過離子裂解途徑分析，可確證該物質(zhì)為肉桂酸芐酯。由以上可總結(jié)出肉桂酸酯類的裂解規(guī)律，如圖5所示。

圖4 正離子下肉桂酸芐酯二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig 4 MS2 spectrum and fragmentation pathways of benzyl cinnamate in positive ion mode

圖5 肉桂酸酯類成分的裂解途徑Fig 5 Fragmentation pathways of cinnamates

苯甲酸在正離子模式下得到準分子離子m/z123.0441 [M＋H]＋，與精確分子質(zhì)量理論值相比，二級匹配的打分MS2score為0.9097，二級碎片離子為m/z105.0337 [M＋H-H2O]＋；在負離子模式下得到準分子離子m/z121.0285 [M-H]-，與精確分子質(zhì)量理論值相比，二級匹配的打分MS2score為0.9811，二級碎片離子m/z77.0389 [M-HCOO]-，經(jīng)過正負離子裂解途徑分析，可確證該物質(zhì)為苯甲酸（見圖6）。

圖6 正離子（A）及負離子模式（B）下苯甲酸二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig 6 MS2 spectrum and fragmentation pathways of benzoic acid in postive ion（A）and negative ion（B）mode

3 討論

蘇合香是一種由樹脂和油狀液體混合而成的復雜物質(zhì)，僅依靠單一指標性成分進行鑒別，很難全面反映蘇合香的內(nèi)在質(zhì)量差異。因此，建立一種同時測定多指標成分的方法十分必要。劉莉等[8]建立了同時檢測蘇合香中肉桂酸肉桂酯、肉桂酸芐酯、苯甲酸芐酯、苯甲酸的GC方法。蘇德民等[9]通過GC-MS技術(shù)分離鑒定出蘇合香中的73個成分，占總提取物色譜峰總面積87%。孫勝南等[10]應(yīng)用GC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)肉桂酸肉桂酯、肉桂酸3-苯基丙酯、肉桂酸、肉桂醇、肉桂酸芐酯和β-石竹烯是蘇合香中含量較高的幾種成分。此外，也有學者應(yīng)用HPLC法檢測出蘇合香中肉桂酸乙酯、肉桂酸芐酯、肉桂酸肉桂酯、苯甲酸芐酯、甲酸、肉桂酸、脫氫松香酸、松香酸等成分[11-12]。目前對蘇合香化學成分分析多為單一方法和個別指標的定性檢測，尚未見蘇合香多技術(shù)聯(lián)用檢測方法的報道，因此，全面分析蘇合香化學成分輪廓對于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選及二次開發(fā)具有重要意義。

3.1 提取溶劑的選擇

以甲醇和正己烷作為蘇合香提取溶劑進行適宜性考察。結(jié)果表明，當使用甲醇作為萃取溶劑時，蘇合香提取液不會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，并且檢測到的色譜峰個數(shù)也更多。因此，本研究最終采用甲醇作為蘇合香的提取溶劑，這一發(fā)現(xiàn)可為后續(xù)蘇合香成分分析提供指導和借鑒。

3.2 GC-TOF-MS識別分析

當應(yīng)用GC-TOF-MS識別蘇合香的化學成分時，恒溫方式很難實現(xiàn)良好的分離，并且會降低質(zhì)譜檢測的分辨率。共鑒定出蘇合香提取物中 25個揮發(fā)性成分，占蘇合香提取物色譜峰總面積的97.7%，其中含量較高的化學成分有肉桂酸肉桂酯（29.46%）、肉桂醇（11.17%）、肉桂酸芐酯（8.83%）、苯甲酸肉桂酯（6.69%）、石竹烯（2.47%）、肉桂醛（2.02%）、苯乙烯（0.77%）等，識別色譜峰總面積占比優(yōu)于目前文獻報道[9]。

3.3 UHPLC-QE-MS識別分析

當應(yīng)用UHPLC-QE-MS識別蘇合香的化學成分時，我們對流動相比例設(shè)置進行了考察，發(fā)現(xiàn)當水相中添加5 mmol·L-1乙酸銨和5 mmol·L-1乙酸時，蘇合香的各成分質(zhì)譜響應(yīng)較好，分辨率最佳。由于蘇合香中多含樹芳香烴類和萜類成分，且部分成分極性十分接近，因此本研究最終采用了方法學中所述的梯度洗脫方式。在正離子和負離子模式下，均鑒定出了系列肉桂酸及其衍生物，且這些衍生物在不同文獻中均有報道[10-11，13]。UHPLC-QE-MS識別分析出的代表性成分有肉桂酸、肉桂醛、肉桂酸肉桂酯、肉桂酸芐酯、苯乙酸肉桂醇酯、苯乙烯、苯甲酸等。此外，我們以正負離子模式下肉桂酸肉桂酯、肉桂酸芐酯和苯甲酸舉例分析了裂解規(guī)律，為蘇合香化學成分識別確認提供試驗基礎(chǔ)。

3.4 未來展望

蘇合香質(zhì)量標準現(xiàn)收載于 2020 年版《中國藥典》一部，主要是針對蘇合香性狀、化學鑒別、薄層鑒別、酸值、皂化值、肉桂酸測定等的研究[14]。針對藥典以蘇合香中的肉桂酸作為質(zhì)量鑒定成分，文獻中多采用堿水解的方式測定水解后的總?cè)夤鹚岬暮浚@種測定轉(zhuǎn)化后的成分而不是選擇測定原形成分，無法體現(xiàn)蘇合香的成分類型，質(zhì)控指標單一且專屬性不強，可能會出現(xiàn)企業(yè)為達到《中國藥典》的標準而摻偽摻假的情況[15]。本試驗通過對蘇合香提取物溶解性以及對其物質(zhì)基礎(chǔ)的了解，采用GC-TOF-MS聯(lián)合UHPLC-QE-MS技術(shù)對蘇合香進行化學成分輪廓研究，發(fā)現(xiàn)肉桂酸肉桂酯、肉桂酸芐酯、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、苯甲酸、苯乙烯等成分可能是蘇合香的代表性化學成分。因此，建議綜合考慮蘇合香標準中含量測定的指標以及前處理方法，增加測定方法的專屬性。