楊屬派間5個種特異性InDel引物及在派間雜交子代鑒別中的應用*

戴曉港 韓峭子 尹佟明

（林木遺傳育種全國重點實驗室 南方現代林業協同創新中心 林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室 江蘇省林木遺傳和高效培育重點實驗室 南京林業大學林學院 南京 210037）

楊樹(Populus)是楊柳科(Salicaceae)楊屬樹種的統稱，因其生長快，適應性強，木材用途廣，被廣泛應用于生態防護林和用材林建設。第九次全國森林資源清查數據顯示，中國現有楊樹人工林757.1萬hm2，是世界上楊樹人工林面積最大的國家(國家林業和草原局, 2019)。目前，我國楊樹人工林推廣的楊樹良種主要是通過常規雜交育種培育，現代生物技術也為實現楊樹精準高效育種提供了新的契機，但雜交育種仍然是目前及今后更長時間培育楊樹新品種的重要手段(李善文等, 2004; 陳贏男等, 2022)。楊屬全世界共有85種，Eckenwalder(1996)根據楊樹形態學特性和種間雜交的可交配性，將楊屬分為5個派，分別是白楊派(Sect.Leuce)，青楊派(Sect.Tacamahaca)，大葉楊派(Sect. Leucoides)，黑楊派(Sect.Aigeiros)和胡楊派(Sect. Turanga)。楊屬派內種間雜交容易，黑楊派和青楊派、黑楊派和大葉楊派之間在自然條件下也容易產生天然雜種，但其余派間存在生殖隔離(Eckenwalder, 1996)。為了拓寬楊樹雜交育種親本的遺傳基礎，聚合不同樹種間的優良基因，國內外學者通過花粉蒙導法、化學試劑熏蒸柱頭法、胚拯救等措施克服了楊屬派間雜交的生殖隔離，獲得了楊屬遠緣雜交子代(Zhanget al., 2005; 彭儒勝等, 2013; 彭儒勝, 2018)。20世紀50—60年代，中國林業科學研究院的育種工作者以小葉楊(P. simonii)為母本與歐洲黑楊(P. nigra)雜交，并選育了小黑楊(Populus ×xiaohei)。徐緯英(1958)開展了山楊×小葉楊、毛白楊×小葉楊等雜交試驗，證實了青楊派與白楊派之間的可配性。董天慈（1980）在20世紀60年代也進行了楊屬不同派間的雜交，其中以小葉楊為母本與父本胡楊(P. euphratica)雜交，獲得了青楊派和胡楊派的雜交子代，選育的小胡楊2號(P. simonii×P.euphratica)于2020年也通過了國家良種認定。彭儒勝等(2013)利用正己烷熏蒸美洲黑楊(P. deltoides)柱頭，分別與胡楊和山楊(P. davidiana)雜交，獲得了黑楊派和胡楊派、黑楊派和白楊派的派間雜交個體。

楊樹雜交通常采用套袋隔離授粉，在雜交過程中易受到和母本同種的花粉污染；在采用花粉蒙導時，如果花粉沒有徹底失去活力，也會導致同種花粉的污染。因此，對種間雜交子代的真實性鑒定是進行雜種選育的基礎。形態學鑒定是最直接的方法，但種間雜交子代一般會出現偏母本型、偏父本型和中間型，且表型性狀受環境條件的影響而性狀表現不同(彭儒勝等, 2013)。分子標記是以遺傳物質核苷酸序列變異為基礎，可以直接反映遺傳物質在DNA水平上的差異，為種間雜交子代的鑒別提供了快速、準確的手段。李毅等(2002)、張玉平等(2015)和李曉宇等(2019)等分別利用RAPD、AFLP標記鑒定楊屬種間雜交子代的真實性，但上述顯性標記易受外源DNA污染，穩定性和重復性差。隨著測序技術的快速發展，SNP分子標記成為第三代分子標記，和其他分子標記相比，SNP分子標記具有分布均勻廣泛、遺傳穩定性高、二等位基因多態性檢測結果易于判讀等特點，而被廣泛用于植物的遺傳多樣性分析、品種鑒別等(賈會霞等, 2015; 黃承玲等, 2021)。本研究基于高通量測序數據，開發楊屬5派之間5種楊樹種特異性InDel分子標記，為鑒別楊屬派間雜交子代的真實性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

美洲黑楊、山楊、小葉楊、大葉楊(P.lasiocarpa)和胡楊，分別來源于楊屬黑楊派、白楊派、青楊派、大葉楊派和胡楊派。其中美洲黑楊自然群體材料收集于江蘇省泗洪縣半城馬浪湖林場有限公司美洲黑楊種質資源庫，每個半同胞家系只選取1株，共取53株；山楊和小葉楊自然群體個體于2020年4月采集于青海省互助縣北山林場大通河流域，每個樹種各采集樣品100份；大葉楊自然群體40個個體采集于湖北恩施太陽河鄉；四川大學馬濤提供的25份胡楊來源于新疆維吾爾自治區塔里木河流域。小胡楊2號由北京林業大學生物科學與技術學院王君提供；黑胡楊(P. deltoides×P. euphratica)由遼寧省楊樹研究所彭儒勝提供；美洲黑楊和小葉楊的種間雜交個體黑小楊(P. deltoides×P. simonii)來源于泗洪縣半城馬浪湖林場有限公司美洲黑楊種質資源庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測 使用植物基因組DNA提取試劑盒(天根DP320)提取楊樹基因組DNA。取約0.1 g新萌發的幼嫩葉片放入2 mL離心管，同時在離心管中加入10粒氧化鋯珠(d=3 mm)，投入液氮中冷凍后，利用Tissuelyser32組織破碎儀，50 Hz研磨30 s，然后迅速向離心管中加入裂解液。參照試劑盒操作步驟提取DNA，使用前在裂解液中加入6 μL巰基乙醇以防止樣品氧化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計測定提取的DNA濃度，根據測定濃度將DNA稀釋至20 ng·μL-1，-20 ℃保存備用。取5 μL稀釋后的DNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA的完整性，電壓5 V·cm-1，電泳時間25 min。

1.2.2 InDel引物在不同種楊樹中通用性的電子檢測將在美洲黑楊和小葉楊中設計的特異性InDel引物(戴曉港等, 2021)，首先采用SeqHunter2(Yeet al.,2012)的默認參數比對到胡楊基因組 (Maet al., 2014)，與胡楊基因組序列完全匹配或僅存在一個堿基差異，且比對上基因組的片段與引物設計的目的片段長度差異不大于50 bp，則默認為引物是在胡楊中通用；依此類推，將胡楊中通用的引物比對到山楊基因組，再將在山楊中通用的引物比對到小葉楊基因組，最后再將小葉楊中通用的引物比對到大葉楊基因組，獲得楊屬不同派5個種的通用性引物。

1.2.3 通用性InDel引物驗證及種內保守引物篩選根據引物通用性電子檢測結果，在不同染色體上共選取48對引物送至南京金斯瑞生物工程有限公司合成。從楊樹5個派中各選取1個DNA對合成引物進行擴增，PCR反應體系10 μL：1 μL 10×Buffer，2 μL 20 ng·μL-1DNA，0.4 μL 2.5 mM dNTP，2 μL 2 μmol·L-1primer，0.5 U ExTaq(Takara)，ddH2O補齊至10 μL。PCR擴增所用儀器為ABI 9700 PCR system，擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 變性30 s，58 ℃ 引物退火30 s，72 ℃延伸30 s，共擴增35個循環；最后72 ℃ 延伸10 min，25 ℃保存。采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測引物通用性及多態性，電泳電壓180 V，電泳時間90 min，篩選出在楊屬5個派的5個不同種中都能成功擴增且種間存在差異的引物。

1.2.4 種間多態引物在種內的保守性驗證 從楊屬5個派的5個種的自然群體材料中，每個樹種取15個不同個體的DNA等量混合，然后利用1.2.3中篩選出的條帶清晰且種間存在差異的引物，對每個樹種的混合DNA進行擴增，PCR反應體系為10 μL：1 μL 10×Buffer，2 μL 20 ng·μL-1DNA，0.2 μL 2.5 mM dNTP，1.0 μL 10 μmol·L-1Fluorescein-12-dUTP，2 μL 2 μmol·L-1正向和反向引物，0.5 U ExTaq，ddH2O補齊至10 μL；擴增程序同1.2.3。擴增后的PCR產物送南京生工生物工程有限公司進行毛細管電泳分型。對于種內保守、種間存在差異的引物，再對5個種的自然群體材料每個樹種各24個個體進行單獨擴增，擴增產物送南京生工生物工程有限公司進行毛細管電泳分型，進一步檢測引物在各個種中的特異性。

1.2.5 種特異性引物進行雜交子代鑒別 選用上述篩選出的種間存在差異、種內保守的引物2對，分別對美洲黑楊×胡楊雜交子代黑胡楊、小葉楊×胡楊雜交子代小胡楊2號以及美洲黑楊×小葉楊雜交子代黑小楊進行擴增，擴增產物經毛細管電泳檢測，驗證楊樹種特異性引物用于3個種間雜交子代鑒別的準確性。

2 結果與分析

2.1 InDel引物在楊屬5個派間的通用性分析

從美洲黑楊和小葉楊差異InDel位點設計的引物數據庫中(戴曉港等, 2021)，隨機選取5 000對引物(引物序列已上傳至https://doi.org/10.6084/m9.figshare.23550081.v2)。將上述引物首先比對到胡楊基因組，通過篩選獲得1 437對胡楊中是通用的引物；將這些在胡楊中通用的引物比對山楊基因組，獲得616對在山楊中通用的引物；再將山楊中通用的引物比對到小葉楊基因組，得到498對在小葉楊中的通用性引物；最后將這些引物再比對到大葉楊基因組，獲得341對在大葉楊中通用引物。這341對引物分別比對胡楊、山楊、小葉楊和大葉楊基因組，理論上這些引物在楊屬5個派的5個種中都可以通用。從不同染色體上選取引物合成，在楊樹19條染色體的其中16條染色體上共選擇了48對引物，用于引物種特異性試驗驗證(表1)。

2.2 InDel引物通用的驗證

分別從楊屬5個派的5個種中取1個DNA對上述引物進行擴增，采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測引物在不同派楊樹中的通用性(圖1)。經過篩選，發現43對引物在楊樹5個派的5個種中均能成功擴增，引物通用率達89.6%，說明經過SeqHunter2的通用性檢測，可有效提高引物的通用性。在這43對引物中，共有19對引物在5個種中擴增條帶清晰且在不同種間存在片段大小的差別，如圖1中的Chr13_10582756、Chr14_8116923、Chr14_8116975、Chr16_23377014和Chr16_4159851等。

圖1 InDel引物在楊屬5個派中的通用性Fig. 1 Universality of InDel primers in five section of Populus

2.3 通用性引物種內保守性初步篩選

對聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測在5個派的5個種中均能成功擴增且不同種間存在長度差異的引物，再用美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊自然群體各15個個體等量混合的DNA進行擴增，檢測引物在種內的保守性及種間的多態性（圖2）。經毛細管電泳檢測發現，引物Chr10_612702在胡楊中能擴增出126 bp和151 bp 2個片段，由于使用混合DNA進行PCR擴增，因此不能準確判斷這2個片段是否在胡楊每個個體中均為特有，這樣的引物則被淘汰。而引物Chr13_10582756在楊屬5個派的5個種15個DNA混和樣品中均只能擴增出單1條帶，且種間存在長度差異，說明這對引物擴增位點在種內不同個體之間是保守的。此外還有3對引物Chr8_9018898、Chr12_4341229和Chr13_1006589也在每個種的混合DNA中均只能擴增出1個條帶，且不同種間存在長度差異，這些引物用于下一步采用自然群體單個DNA進行種內保守性和種間差異性驗證。

圖2 混合DNA檢測InDel引物在楊屬5個派中的保守性Fig. 2 Conservation of InDel primers tested by mixed DNA in five section of Populus

2.4 物種特異性引物篩選

對混合DNA檢測在種內保守、種間存在差異的Chr8_9018898、Chr12_4341229、Chr13_1006589和Chr13_10582756引物，分別從美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊的自然群體材料中各取24個不同個體，對每個樣品單獨擴增，進一步進行種內保守性和種間差異性檢測。擴增產物經毛細管電泳檢測發現，上述4對引物中，只有Chr12_4341229和Chr13_10582756在每個派的樹種中擴增的條帶均為保守序列，且不同種間存在長度差異。引物Chr12_4341229在美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊中均只能擴增出1個位點，條帶大小分別為148、152、152、159和113 bp (圖3)。引物Chr13_10582756在美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊中也均只能擴增出1個位點，條帶大小分別為140、144、140、159和116 bp (圖4)。

圖3 引物Chr12_4341229擴增美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊自然群體Fig. 3 Partial amplification results of primer Chr12_4341229 of five different natural population of poplar species

圖4 引物Chr13_10 582 756擴增美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊自然群體結果Fig. 4 Partial amplification results of primer Chr13_10 582 756 of five different natural population of poplar species

2.5 種特異性引物檢測種間雜交子代的真實性

利用引物Chr12_4341229和Chr13_10582756分別對黑胡楊、小胡楊和黑小楊進行PCR擴增，擴增產物經毛細管電泳檢測，結果見圖5。引物Chr12_4341229在黑胡楊中可以檢測到140 bp和159 bp 2個片段，同樣引物Chr13_10582756在黑胡楊中也可以檢測到148bp和159 bp 2個片段。2對引物均檢測到2條片段，其中一條均來自美洲黑楊，而另一條則來自胡楊，這與美洲黑楊和胡楊自然群體個體檢測的結果一致，由此可判斷雜交子代為美洲黑楊和胡楊的種間雜交子代。同樣在小胡楊2號及黑小楊中，2對引物均擴增出2個條帶，對比自然群體擴增結果，也證實了黑小楊和小胡楊2號均為真實的派間雜交子代。

圖5 引物Chr12_4341229和Chr13_10582756檢測種間雜交子代真實性Fig. 5 Interspecific hybrids authenticity identification by primers of Chr12_4341229 and Chr13_10582756

3 討論

雜交是林木種質創新和品種改良的重要手段和方法之一。楊屬胡楊派胡楊具有耐干旱貧瘠、耐鹽堿等特性(Maet al., 2014)，為了將耐鹽堿、耐干旱基因聚合到其他速生楊樹中，國內外學者進行了大量的派間雜交試驗，結果表明胡楊和楊屬其余4個派之間雜交不親和(張金鳳等, 2007; DiFazioet al., 2011)。近年來，楊樹育種學家采用花粉蒙導、正己烷熏蒸柱頭等措施，利用胡楊花粉分別和青楊派小葉楊、黑楊派美洲黑楊進行雜交，獲得了派間雜交子代。但育苗時也發現，雜交子代一般會出現偏母本型、偏父本型和中間型，因此，派間雜交子代的真實性難以鑒定。分子標記技術為楊樹遠緣雜交子代的真實性鑒定提供了可能，如RAPD和AFLP等用于楊屬不同派間雜交子代鑒定，提升遠源雜交真實性(江錫兵等, 2013;張玉平等, 2015; 李曉宇等, 2019)，但顯性分子標記存在鑒定重復性差、操作復雜等缺陷。利用共顯性SSR分子標記對以銀腺楊為母本，不同個體毛白楊混合花粉雜交子代的真實性鑒定，采用15對SSR引物對F1代個體進行父本鑒定，鑒定率為84.1%；而對胡楊和美洲黑楊派間雜交子代的真實性鑒別時僅采用了1對SSR引物(彭儒勝等, 2013)。雖然獲得的子代也為真實的派間雜交子代，但如果供體花粉在這個SSR位點和母本同種的雄株相同，就會出現鑒別錯誤(圖6)。物種特異性引物是進行種間鑒別的理想標記，如張紅蓮等(2010)通過對鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）和北美鵝掌楸（Liriodendron chinense）自然群體的篩選，開發出一對種特異性引物，為鵝掌楸、北美鵝掌楸種間雜交子代的真實性鑒定提供了一種快速、簡便穩定的方法。戴曉港等(2021)基于美洲黑楊和小葉楊的重測序序列開發了2對美洲黑楊和小葉楊的種特異性引物，任意1對引物均可以用于黑楊派和青楊派種間雜交子代的真實性鑒別。本研究以楊屬5個派別中的美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊自然群體為材料，開發了2對楊屬不同種的特異性引物，可以用于楊屬5個不同派間雜交子代的鑒別，即使污染花粉來自母本同種個體，2對引物組合即可使鑒別的準確率達到100%(圖6)。

圖6 常規SSR標記和物種特異性分子標記檢測種間雜交子代示意Fig. 6 Schematic diagram of conventional SSR and species-specific molecular marker for identification of interspecific hybrid offspring

物種特異性引物在種間雜交子代的真實性鑒別中具有鑒別準確率高、重復性好、穩定性高、操作簡單等特點。但由于種間雜交子代鑒別的種特異性引物開發需要大量自然群體材料進行PCR擴增驗證，如張紅蓮等(2010)在篩選鵝掌楸和北美鵝掌楸種特異性引物時，初步篩選的8對的引物要分別對2個樹種各30個個體進行480個PCR擴增反應，最終篩選出1對種特異性引物。賈婕等（2014）在進行馬尾松和濕地松種特異性引物開發時，需要采用初步篩選的15對引物對馬尾松不同種源30個個體和濕地松不同種源31個個體單獨擴增，共進行915個PCR擴增反應，然后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，也僅篩選到1對引物可以用于這2個種的種間雜交子代檢測。本研究中初步篩選的19對引物用5個樹種進行特異性檢測時，如果按照上述研究方案需要進行2 850個PCR反應，但在進行種特異性引物篩選時，將同1個種自然群體個體的DNA進行等量混合，再采用引物對混合DNA進行擴增檢測，僅進行了95個PCR擴增反應，篩選出4對在種內保守但在5個種間存在差異的引物，上述結果說明采用混合DNA篩選種特異性引物不但是可行的，同時還可以大大提高篩選效率。對混合DNA篩選獲得的引物，最后再采用5個種各24個單獨DNA對這4對引物進行驗證，最終篩選出2對引物可以用于美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊任意2個種間雜交子代的真實性鑒別。

4 結論

從美洲黑楊和小葉楊中種特異性的5 000對InDel引物中，篩選出341對在5個派的5個種之間通用的引物。從不同的染色體上共選取48對引物，最終篩選出2對引物在楊屬派間5個種中存在長度差異而在派內保守。2對引物同時使用，可以用于美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊任意2個種間雜交子代的真實性鑒別。