miR-384靶向HMGA2對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

馬 偉 張 空 李夢珂

肝癌是全球范圍內(nèi)常見的一種惡性腫瘤,由于肝癌細(xì)胞增殖迅速,且易侵犯門靜脈,導(dǎo)致肝內(nèi)擴(kuò)散嚴(yán)重,且早期無明顯臨床特征,因此多數(shù)患者就診時(shí)已處于肝癌晚期,臨床預(yù)后效果不佳,患者5年生存率低下,因此尋找治療肝癌細(xì)胞增殖和擴(kuò)散的有效靶點(diǎn)和藥物至關(guān)重要[1-2]。miRNAs是一類廣泛存在于真核生物中的非編碼RNA,通過與靶基因的3'末端非翻譯區(qū)結(jié)合發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,研究發(fā)現(xiàn),miR-384在肝癌細(xì)胞中顯著下調(diào),上調(diào)miR-384可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[3]。高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)在增殖基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用,而這一作用可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[4]。研究表明,miR-26a靶向抑制HMGA2表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[5]。此外,HMGA2在肝癌組織中表達(dá)明顯上調(diào),長鏈非編碼RNA(LncRNA)-ZFAS1通過結(jié)合HMGA2可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[6]。miR-384是否能通過調(diào)節(jié)HMGA2表達(dá)發(fā)揮抗肝癌作用的相關(guān)報(bào)道甚少,因此本研究通過上調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-384表達(dá),探討miR-384對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響以及對HMGA2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

肝臟正常上皮細(xì)胞THLE3以及肝癌細(xì)胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7購自美國ATCC公司。

1.2 試劑和儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及PCR試劑盒購自美國Sigma公司;miR-384 NC和miR-384 mimic 由上海生工公司合成;miR-384引物序列由廣州銳博生物科技有限公司合成;多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司;倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯;熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 qRT-PCR檢測miR-384在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。離心收集細(xì)胞,Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),miR-384的引物序列見表1。

表1 miR-384引物序列

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于6孔板,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長后,每孔20 μl MTT溶液(5 mg/ml)孵育4 h,棄掉上層培養(yǎng)液,二甲基亞砜(DMSO)150 μl孵育,將細(xì)胞置于酶標(biāo)儀上設(shè)置波長為490 nm,測定吸光度(A)值。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

細(xì)胞遷移能力檢測:收集細(xì)胞,制成密度為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,在每個(gè)小室中加入200 μl細(xì)胞懸液,下室中加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,將小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,用濕棉簽輕輕拭去上室中殘余的細(xì)胞,多聚甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min,封片,顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量取平均值。

細(xì)胞侵襲能力檢測:上室中鋪滿基質(zhì)膠,其余操作同上。

1.6 雙熒光素酶基因報(bào)告法檢測靶向關(guān)系

TargetScan軟件預(yù)測miR-384與HMGA2的3' UTR端存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn),將該結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行擴(kuò)增,構(gòu)建野生型(wt)和突變型(mut)HMGA質(zhì)粒,將兩種質(zhì)粒分別與miR-384 mimic和mimic NC共同轉(zhuǎn)染入HUH7細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng),測定熒光素酶活性。

1.7 蛋白印跡法檢測HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相對表達(dá)量

收集細(xì)胞進(jìn)行裂解,離心收集細(xì)胞上清液,測定蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度并煮沸變性。每個(gè)樣本取20 μg蛋白進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后,將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%胎牛血清封閉,GAPDH、HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin 抗體(1∶1000)4℃孵育過夜,二抗(1∶5000)室溫孵育1 h,洗膜,顯色,計(jì)算灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-384在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

肝癌細(xì)胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表達(dá)水平[(6.19±0.20),(6.44±0.62),(3.19±0.61)]均顯著低于肝臟正常上皮細(xì)胞THLE3(9.33±0.78)(P<0.05)。

2.2 HUH7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-384結(jié)果

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組miR-384表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞miR-384水平比較

2.3 miR-384過表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組肝癌細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組肝癌細(xì)胞存活率比較

2.4 miR-384過表達(dá)對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組肝癌細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均減少(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 結(jié)晶紫染色檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力(×400)

表4 各組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.5 雙熒光素酶基因報(bào)告法結(jié)果

與miR-384 NC+Wt HMGA2組比較,miR-384 mimic+Wt HMGA2組熒光素酶活性降低(P<0.05);miR-384 NC+Mut HMGA2組與miR-384 mimic+Mut HMGA2組熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2,表5。

表5 熒光素酶活性比較

2.6 miR-384過表達(dá)對細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組HMGA2、N-cad和Vimentin蛋白相對表達(dá)量降低,E-cad蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖3,表6。

圖3 蛋白印跡法檢測細(xì)胞中HMGA2、N-cad、Vimentin和E-cad蛋白表達(dá)情況

表6 各組細(xì)胞中HMGA2、N-cad、E-cad和Vimentin蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

目前,臨床上對肝癌的治療具有多種手段,主要包括:手術(shù)切除、肝臟移植、局部射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)等,但治療效果并不理想[7]。該惡性腫瘤的病因、發(fā)病機(jī)制以及新的靶向治療方法一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。miR-384已被證明在多種惡性腫瘤中具有抑癌作用,例如乳腺癌、鼻咽癌以及腎細(xì)胞癌等[8-9]。在肝癌細(xì)胞中,Circ-0008285通過靶向作用于miR-384可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[10]。本研究通過上調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-384表達(dá),探討其對肝癌細(xì)胞的影響及其具體機(jī)制。

首先本研究通過檢測人正常肝上皮細(xì)胞THLE3以及肝癌細(xì)胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表達(dá)水平發(fā)現(xiàn):肝癌細(xì)胞中miR-384表達(dá)水平顯著低于正常肝上皮細(xì)胞,其中以HUH7細(xì)胞中miR-384降低最為顯著。因此本研究通過上調(diào)miR-384在HUH7細(xì)胞中表達(dá)水平,探討miR-384對肝癌細(xì)胞的影響。肝癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處器官或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素,因此降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力對治療肝癌具有重要的意義[11]。本研究結(jié)果顯示:對照組和miR-384 NC組細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明miR-384 NC對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力不產(chǎn)生影響;與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組細(xì)胞存活率降低,遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少,說明miR-384可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn),HMGA2在乳腺癌細(xì)胞中過度激活,下調(diào)HMGA2表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲,阻礙裸鼠乳腺癌移植瘤生長。此外,HMGA2過表達(dá)增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性[13]。Wang等[14]研究表明miRNA-363-3p通過靶向抑制HMGA2從而發(fā)揮抗肝癌作用。由此可見,HMGA2表達(dá)水平與肝癌進(jìn)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-384可直接靶向作用于HMGA2,而且miR-384 mimic組細(xì)胞中HMGA2蛋白相對表達(dá)量低于miR-384 NC組,說明miR-384靶向抑制HMGA2蛋白表達(dá)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ),E-cad、N-cad和Vimentin是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志蛋白[15]。在本次實(shí)驗(yàn)中與miR-384 NC組比較,miR-384 mimic組E-cad蛋白表達(dá)升高,N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)降低,說明上調(diào)miR-384表達(dá)可逆轉(zhuǎn)EMT過程,抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述,miR-384可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其可能是通過靶向抑制HMGA2從而逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來發(fā)揮作用。