UbcH7 及53BP1 基因在結直腸癌中的表達及意義

黃立勇，竇廣健，吳佳明

結直腸癌為消化道最常見的惡性腫瘤，近年來發病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者生存質量[1]。結直腸癌早期臨床表現不明顯，患者就診時往往處于進展期而失去根治手術機會，預后不佳。研究結直腸癌標志物對早期診斷、及早期治療具有重要意義[2]。泛素交聯酶L3（ubiquitin conjugating enzyme L3，UbcH7）為E2 泛素交聯酶蛋白的成員之一，可參與多種底物蛋白的泛素化并調節核因子B、糖原合成酶激酶-3 /p65（GSK3 /p65）等多個信號通路，與惡性腫瘤細胞遷移、侵襲及上皮間質轉化相關[3]。p53結合蛋白1（p53 binding protein，53BP1）功能包括調控細胞周期及DNA損傷修復等，與結直腸癌中DNA雙鏈斷裂修復過程有關[4]。目前UbcH7 及53BP1 在結直腸癌發病機制中的作用尚未明確。本研究檢測結直腸癌患者UbcH7 及53BP1 基因表達，分析其與臨床病理因素和預后的關系，并探討其在結直腸癌發病機制及預后評估中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年1 月至2020 年1 月嘉興市第一醫院收治的98 例結直腸癌患者為研究對象。其中男64 例，女34 例；年齡45 ～76 歲，平均（61.1±8.5）歲。納入標準：（1）經腸鏡、術中或術后病理組織學檢查確診，符合《中國結直腸癌診療規范》診斷標準；（2）患者及家屬知情并同意本研究；（3）術中獲取的組織標本保存完整，隨訪資料完整；（4）首次診治，既往未行手術、放化療及靶向藥物治療等。排除標準：（1）合并身體其他部位惡性腫瘤者；（2）合并急性感染性腸炎、腸結核、炎癥性腸病等腸道疾病者；（3）有嚴重心、肝、腎功能不全及全身感染性疾病、自身免疫性疾病者；（4）臨床資料不完整，合并神經精神疾病，無法配合本研究患者。本研究經嘉興市第一醫院倫理委員會批準（審批號：LS2018-078）。

1.2 方法

1.2.1 UbcH7 和53BP1 基因mRNA 表達檢測 收集本組結直腸癌患者癌組織及癌旁正常組織迅速置于凍存管中并投入液氮中保存待測。提取組織總RNA 純化并定量，采用實時熒光定量PCR（qRTPCR）檢測UbcH7 和53BP1 基因mRNA 表達，檢測儀器為美國ABI 公司7500 型，引物序列見表1。反應體系共20l：模板cDNA（50 ng/l）2l，上下游引物（10mol/L）各0.5l，SYBR Green Master Mix（2×）（江西艾博因生物科技有限公司，貨號：IBIOC141）10l，ddH2O 加至20l。選擇GAPDH 為內參，采用2Ct方法計算UbcH7 和53BP1 基因mRNA 相對表達量。

表1 UbcH7、53BP1、GAPDH 引物序列

1.2.2 UbcH7 和53BP1 基因蛋白表達檢測 取癌組織和癌旁正常組織樣本固定、脫水、石蠟包埋后進行連續切片。采用SP 法檢測UbcH7 和53BP1 基因蛋白表達。免疫組化染色結果判定采用半定量法評估（即染色強度得分×陽性表達率得分），最終評分≤3 分視為陰性表達，＞3 分視為陽性表達[5]。

1.2.3 臨床病理資料收集及預后隨訪 收集患者一般臨床資料、腫瘤大小、組織學分級、病理類型、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期等資料。患者每3 個月電話或門診隨訪1 次，內容包括生存情況、治療情況（包括藥物治療等）、生存質量、癥狀體征改變及影像學檢查。隨訪時間至2023 年3 月（隨訪終點）。統計患者3 年生存率、預后終點事件（死亡或存活）。

1.3 統計方法 采用SPSS 25.0 軟件對數據進行處理和分析。計數資料采用2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，采用配對t檢驗。結直腸腫瘤組織UbcH7與53BP1 的mRNA及蛋白表達水平的相關性分別采用Pearson 和Spearman 相關性分析；ROC 曲線分析結直腸腫瘤組織UbcH7 和53BP1 基因mRNA 表達預測3 年生存期的效能；結直腸腫瘤組織UbcH7 和53BP1蛋白表達與患者預后的關系采用Kaplan-Meier法分析。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UbcH7 和53BP1 基因mRNA和蛋白表達比較結直腸腫瘤組織中UbcH7 基因mRNA 表達及蛋白陽性率均高于癌旁正常組織，53BP1 基因mRNA表達及蛋白陽性率均低于癌旁正常組織（均P ＜0.05），見表2、圖1。

圖1 UbcH7 和53BP1 蛋白在結直腸腫瘤組織和癌旁正常組織中的陽性表達（SP 法，×400）

表2 結直腸腫瘤組織和癌旁正常組織中UbcH7、53BP1 表達水平比較

2.2 UbcH7 和53BP1 基因mRNA和蛋白表達的相關性分析 直腸腫瘤組織中UbcH7 基因mRNA 和53BP1 基因mRNA表達水平呈負相關（r=－0.626，P＜0.05），見圖2。結直腸腫瘤組織中UbcH7 和53BP1蛋白表達呈負相關（r=－0.795，P ＜0.05），見表3。

圖2 UbcH7 基因mRNA和53BP1基因mRNA 表達水平的相關性

表3 UbcH7 和53BP1 蛋白表達的相關性

2.3 UbcH7 和53BP1 蛋白表達與臨床病理特征的關系 不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度的結直腸癌患者UbcH7 和53BP1 蛋白表達比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。TNM 分期為Ⅲ+IV 期、淋巴結轉移N1+N2 的結直腸癌患者UbcH7陽性表達、53BP1 陰性表達比例高于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期、淋巴結轉移N0 的結直腸癌患者，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），見表4。

表4 UbcH7 和53BP1 蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 例（%）

2.4 UbcH7 和53BP1 基因mRNA表達預測3 年生存期的效能 UbcH7 基因mRNA 預測3 年生存期的截斷值為1.17，敏感度為0.789，特異度為0.824，AUC 為0.726。53BP1 基因mRNA預測3 年生存期的截斷值為0.73，敏感度為0.815，特異度為0.791，AUC 為0.804，見圖3。

圖3 UbcH7 和53BP1 基因mRNA 表達預測3 年生存期的ROC 曲線

2.5 UbcH7 和53BP1 蛋白表達與3 年生存率的關系 采用Kaplan-Meier 法分析UbcH7 和53BP1 蛋白表達與3 年生存率的關系，結果顯示UbcH7 陽性表達患者3 年生存率（38/70，54.29%）低于陰性表達患者（25/28，89.29%）（2=9.201，P＜0.05）；53BP1陽性表達患者3 年生存率（22/24，91.67%）高于陰性表達患者（41/74，55.41%）（2=8.859，P＜0.05），見圖4 ～5。

圖4 UbcH7 蛋白表達與患者3 年生存率的關系

圖5 53BP1 蛋白表達與患者3 年生存率的關系

3 討論

結直腸癌的流行病學在世界不同地區及不同年齡、性別和種族群體間差異較大，這種差異涉及風險因素暴露、遺傳易感性和遺傳突變、基因表達差異等多種因素[6]。越來多的證據表明，UbcH7 的異常表達和許多類型的癌癥發生有關[7]。宋寧寧等[8]研究結果顯示乳腺浸潤性導管癌患者UbcH7 表達上調，且與臨床分期及不良預后有關。Tao 等[9]研究顯示，肝細胞癌中UbcH7 的過度表達通過抑制GSK3 /p65 通路增強細胞凋亡逃逸。本研究發現結直腸患者腫瘤組織中UbcH7 的mRNA 和蛋白表達水平顯著高于癌旁正常組織，推測UbcH7 在結直腸癌中可能發揮促癌基因作用。

維持基因組的完整性和穩定性是細胞內DNA損傷修復反應的關鍵責任，此種基于激酶的信號通路的任何環節被破壞均會導致各種疾病的發展，尤其是癌癥。53BP1 作為細胞內DNA 損傷修復反應的主要介質之一，在DNA 雙鏈斷裂修復途徑的選擇中發揮著關鍵作用[10]。Huang 等[11]研究結果表明，53BP1 缺失抑制了鹽酸依替尼對結直腸癌細胞的放射增敏作用。本研究結果顯示，結直腸腫瘤組織中53BP1 基因mRNA 及蛋白表達水平均顯著降低，推測53BP1 的減少或缺失使得其無法迅速高效的集中在DNA 雙鏈斷裂損傷部位并參與其損傷修復反應，進而導致基因組完整性和穩定性被破壞，無法有效抑制結直腸癌的病理進展。泛素-蛋白酶體系統是一種主要的蛋白質降解途徑，它維持細胞中的蛋白質穩態[12]。研究顯示，UbcH7 參與了53BP1 的蛋白酶體降解途徑[13]。本研究相關性結果顯示，UbcH7 和53BP1 的mRNA 和蛋白表達水平均呈顯著相關性，且二者表達水平與TNM分期和淋巴結轉移有關。據此推測，UbcH7 表達上調后可能通過相關通路及泛素化修飾作用下調53BP1 的表達水平，進而影響DNA 損傷修復過程，正常細胞的增殖行為被抑制而結直腸癌細胞的增殖能力增強，為結直腸癌的惡性轉移奠定基礎，推動結直腸癌細胞的惡性生物學行為進展。此外，本研究結果中，結直腸腫瘤組織UbcH7陽性表達、53BP1 陰性表達患者3 年生存率較低。Huang等[14]研究結果顯示，與53BP1 低表達相比，53BP1的高表達有效地提高了直腸癌患者3 年的生存率，本研究結果與其部分一致。推測UbcH7 表達水平升高和53BP1表達水平降低不利于結直腸癌患者預后，其可能通過相互影響共同促進結直腸癌細胞的轉移、侵襲等，進而推動結直腸癌的病理進展。

綜上所述，結直腸腫瘤組織UbcH7表達水平升高，53BP1 表達水平降低，二者表達水平呈負相關且與TNM 分期、淋巴結轉移、3 年生存率有關，可能共同參與結直腸癌的病理進展。UbcH7 高表達、53BP1 低表達可能與結直腸癌患者死亡密切相關，可能是結直腸癌新的預后不良腫瘤標志物。值得注意的是，本研究為單中心研究且臨床病例較少，UbcH7 和53BP1 基因表達在結直腸癌中的臨床價值有待于進一步研究證實。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 黃立勇：實驗操作、論文撰寫；黃立勇、竇廣健：數據整理、統計學分析；吳佳明：研究指導、論文修改、經費支持