巨細胞病毒抗原血癥檢測在腎移植術后的應用

白敏鳳，胡偉，馬寅銳，賈蔚，尹利民（.昆明市第一人民醫院檢驗科，云南昆明 6504；.昆明市第一人民醫院泌尿外科，云南 昆明 6504；.昆明市第一人民醫院醫院感染管理辦公室，云南 昆明 6504）

腎移植是終末期腎病患者的最佳治療選擇，是改善終末期腎病患者的生活質量和生存率的有效方式。但免疫抑制及感染風險仍然是主要問題［1］。巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是影響實體器官移植（solid organ transplantation，SOT）結局的最常見的機會性感染之一［2］，在不同的腎移植受者中，有40% ～ 100%的患者發生主動感染［3］。CMV與腎移植后肺炎、肝炎、視網膜炎及腎移植后急、慢性排斥反應的發生有著密切聯系［2］。實驗室檢測巨細胞病毒的方法包括：分子測定、抗原血癥檢測、組織病理學、病毒培養和血清學檢測等。病毒培養法檢測巨細胞病毒具有高度特異性，但因靈敏度低和周轉時間長應用逐漸減少。組織病理學是診斷巨細胞病毒感染的金標準，但由于是侵入性操作，除非在有嚴重組織受累時才需要完善該檢查。目前臨床上常規的CMV 檢測多數都是檢測血清中的IgG、IgM 抗體以及實時熒光定量PCR 的方法來檢測巨細胞病毒的感染。但對于器官移植患者等人群，CMV 活動性感染或疾病的有效治療以及采取先發制人的策略都需要早期、準確的診斷才能獲得更好的結果。而移植后腎功能的評估，肌酐、他克莫司（tacrolimus，Tac/FK506）、淋巴細胞亞群具有重要的意義。因此，本研究對CMV 不同檢測方法進行比較，通過檢測腎移植患者的肌酐、FK506 藥物濃度、淋巴細胞亞群等項目，評估CMV pp65 抗原血癥檢測在腎移植患者中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般資料：選取2021 年9 月至2021 年12 月昆明市第一人民醫院就診90 例腎移植患者的110 例血樣。（其中20 例腎移植患者重復就診），分別進 行CMV pp65 抗 原、CMV IgG、IgM 抗 體、CMV DNA、肌酐、淋巴細胞亞群、FK506 藥物濃度等檢測。

1.1.2 實驗儀器：全自動化學發光免疫分析儀、熒光定量PCR 儀、液基薄層細胞制片機、全自動生化分析儀、BD 流式細胞儀等

1.1.3 實驗試劑：CMV IgG 抗體檢測試劑盒（化學發光法）、CMV IgM 抗體檢測試劑盒（化學發光法）、HCMV 核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）、他克莫司測定試劑盒（化學發光法）、肌酐測定試劑盒（氧化酶法）、BD Multitest IMK Kit。

1.2 實驗方法

1.2.1 CMV pp65 抗原血癥檢測方法建立

1.2.1.1 外周血白細胞的分離：1 ml BD MultitestTMIMK Lysing Solution 加 入 待 測 標 本100 μl EDTA-K2抗凝全血混勻，離心、棄去上清液，取沉淀加1ml PBS 緩沖液，混勻后（12000 r×1 min）高速離心，計數白細胞數量，制成濃度為2×105/ml 外周血白細胞懸液。

1.2.1.2 細胞甩片機制片：取外周血白細胞懸液100 μl 制得外周血白細胞玻片。

1.2.1.3 免疫熒光染色：將PBS 1：1000 稀釋后的抗HCMV pp65 單克隆抗體覆蓋玻片，玻片置于37℃溫箱孵育30 min（之后的步驟盡量不要讓玻片干掉），沖洗浸泡，PBS 1：500 稀釋后的FITC 標記羊抗鼠IgG 抗體覆蓋玻片，避光37℃溫箱孵育30 min，同樣沖洗浸泡5 min，洗掉未結合物質。封片，避光保存。

1.2.1.4 熒光顯微鏡觀察：陽性細胞核及細胞質熒光標記，呈黃綠色，鏡下陽性細胞≥1 個，則認為該樣本CMV 抗原血癥陽性。

1.2.2 CMV IgG、IgM 抗體檢測：待測樣本分離膠管新鮮血清在MAGLUMI X8 全自動化學發光免疫分析儀檢測。

1.2.3 CMV DNA 檢測 EDTA-K2 抗凝全血1 ml，按照CMV DNA 檢測的標準化操作流程進行檢測。

1.2.4 一般項目檢測：肌酐、淋巴細胞亞群、FK506 藥物濃度均按照標準化流程留取標本并進行檢測。

1.3 統計學處理：采用SPSS 21.0 對數據資料進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示。采用t 檢驗比較兩組間差異。不符合正態分布的數據采用Box-Cox 轉換成正態分布進行統計分析。計數資料率的組間比較采用卡方檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CMV pp65 抗原血癥結果與CMV DNA 一致性比較：在對昆明市第一人民醫院90 例腎移植受體的110 例血液樣本的檢測，CMV pp65 與CMV DNA同時陰性有45 例，同時陽性有27 例，一致性為65.5%（表1）。經Fisher 精確檢驗，差異具有統計學意義（P ＜0.05）。

2.2 CMV pp65 抗原血癥結果與CMV IgG 抗體一致性比較：在對110 例標本的CMV pp65 與IgG 抗體結果的比較中，CMV pp65 與IgG 抗體同時陰性1 例，同時陽性有62 例，一致性為57.3%（表2）。經Fisher 精確檢驗，差異不具有統計學意義（P ＞0.05）。

表2 CMV pp65 結果與CMV IgG 抗體定性結果比較

2.3 CMV pp65 抗原血癥結果與血清肌酐比較：納入樣本110 例，數據不服從正態分布，采用BOXCOX 變換數據，如表3 所示，CMV pp65 抗原血癥陰性46 例，肌酐平均值為（1.149±0.006）μmol/L，CMV pp65 抗原血癥陽性64 例，肌酐平均值為（1.150±0.006）μmol/L，CMV pp65 抗原血癥與肌酐差異無統計學意義（t ＝-0.729，P ＝0.468）。

表3 CMV pp65 抗原血癥結果與肌酐的比較

2.4 CMV pp65 抗原血癥結果與FK506 藥物濃度比較（表4）：納入樣本96 例，數據服從正態分布，采用t 檢驗統計分析。CMV pp65 抗原血癥陰性39 例，FK506 藥物濃度平均值為（6.25±2.22）ng/ml，CMV pp65 抗原血癥陽性57 例，FK506 藥物濃度平均值為（6.63±2.47）ng/ml，CMV pp65 抗原血癥與FK506 藥物濃度差異無統計學意義（t ＝-0.768，P ＝0.445）。

表4 CMV pp65 抗原血癥與FK506 藥物濃度的比較

2.5 CMV pp65 抗原血癥結果與淋巴細胞亞群比較：納入樣本43 例，CMV pp65 抗原血癥陽性24 例，陰性19 例。CD8+T 細胞比例（CD3+CD8+/CD45+）、CD4+T 細胞比例（CD3+CD4+/CD45+）數據符合正態分布，采用t 檢驗進行統計分析；T 細胞比例（CD3+/CD45+）、NK 細 胞 比 例（CD16+CD56+/CD45+）、B 細胞 比 例（CD19+/CD45+）、CD4+T 細 胞/CD8+T 細 胞（Th/Ts）、CD3+總T 細 胞 絕 對 值、CD8+T 細 胞（Ts/Tc）絕 對 值、CD4+T 細 胞（Th/Ti）絕 對 值、CD4+CD8+雙陽性T 細胞絕對值、NK 細胞絕對值、B 細胞絕對值不符合正態分布，采用Box-Cox 將非正態分布數據轉換為正態分布。CMV pp65 抗原血癥結果與T 細胞比例（CD3+/CD45+）、CD8+T 細胞比例（CD3+CD8+/CD45+）、CD4+T 細胞比例（CD3+CD4+/CD45+）、NK 細胞比例（CD16+CD56+/CD45+）、B 細胞比例（CD19+/CD45+）、CD4+T 細 胞/CD8+T 細 胞（Th/Ts）、CD3+總T 細胞絕對值、CD8+T 細胞（Ts/Tc）絕對值、CD4+T 細胞（Th/Ti）絕對值、CD4+CD8+雙陽性T 細胞絕對值、B 細胞絕對值差異無統計學意義（P ＞0.05）。CMV pp65 抗原血癥結果與NK 細胞絕對值差異有統計學意義（P ＜0.05）。如表5所示。

表5 CMV pp65 抗原血癥與淋巴細胞亞群的比較（±s）

表5 CMV pp65 抗原血癥與淋巴細胞亞群的比較（±s）

Box-Cox 轉換前 Box-Cox 轉換后淋巴細胞亞群t P陰性 陽性 陰性 陽性T 細胞比例（CD3+/CD45+）56.50±24.22 67.24±21.11 751.13±364.59 760.00±386.51 -0.077 0.939 CD8+T 細胞比例（CD3+CD8+/CD45+）CD4+T 細胞比例（CD3+CD4+/CD45+）NK 細胞比例（CD16+CD56+/CD45+）B 細胞比例（CD19+/CD45+）CD4+T 細胞/CD8+T 細胞（Th/Ts）31.00±12.57 35.24±14.65 31.00±12.57 35.24±14.65 0.596 0.554 23.32±14.49 29.67±14.73 23.32±14.49 29.67±14.73 -0.639 0.527 18.14±13.41 13.10±6.99 5.52±2.49 4.22±1.97 1.912 0.063 24.18±27.29 18.24±19.68 1.96±0.80 2.28±0.66 -1.456 0.153 0.75±0.41 0.94±0.59 -0.37±0.55 -0.17±0.56 -1.191 0.241 CD3+總T 細胞絕對值 1.00±0.91 0.87±0.77 -0.10±1.01 -0.54±0.89 1.524 0.135 CD8+T 細胞（Ts/Tc）絕對值0.51±0.48 0.40±0.30 -0.64±0.73 -1.02±0.57 1.905 0.064 CD4+T 細胞（Th/Ti）絕對值CD4+CD8+雙陽性T 細胞絕對值0.43±0.45 0.43±0.49 -0.99±0.99 -1.25±0.92 0.887 0.380 0.01±0.02 0.01±0.01 -6.63±2.23 -7.21±1.61 0.973 0.337 NK 細胞絕對值 0.29±0.31 0.15±0.14 -1.24±0.75 -1.73±0.67 2.247 0.030 B 細胞絕對值 0.18±0.14 0.15±0.11 -1.77±0.70 -1.80±0.55 0.161 0.873

3 討 論

CMV 是影響SOT 預后的一個重要的病原微生物，在腎移植術后不僅常見，而且嚴重影響腎移植的發病率和病死率［4-6］。CMV 復制存在于組織、血液或其他體液中，與癥狀無關，可通過核酸檢測（NAT）、抗原檢測和病毒培養法來檢測 CMV 的復制。根據所使用的方法，血液中的 CMV 復制可以稱為CMV DNA 血癥 、CMV 抗原血癥和CMV 病毒血癥［7-8］。CMV DNA 檢測是目前首選的診斷CMV感染的方法，被廣泛地用于臨床中診斷 CMV 疾病，確定何時開始先發性抗病毒治療（PET）以及監測感染和/或疾病進程［9-10］，但該方法在區分潛伏性或活動CMV 感染方面具有一定局限 性。 而CMV pp65 抗 原 血 癥 通 過 檢 測CMV pp65 抗 原 來 診 斷CMV 感 染。pp65 抗 原 在CMV DNA 復制前就有合成，在出現臨床癥狀前2 ～ 10 d 內可明顯增高，CMV pp65 抗原陽性提示體內活動性巨細胞病毒復制完成，是HCMV 活動性感染的早期標志性產物［11］。腎移植患者對活動性感染或疾病的有效治療以及采取先發制人的策略都需要準確、早期的診斷才能獲得更好的結果，因此需要快速且準確的診斷方法［6］。目前對腎移植進行移植后監測的策略包括連續測量血清肌酐水平、臨床隨訪以及腎臟活檢等［12］。肌酐是目前常用的評估SOT后患者腎功能的常用指標。腎移植術后患者常規服用免疫抑制劑包括環孢素A、他克莫司等，通過調整免疫抑制劑的劑量來保持患者的免疫系統平衡。因此，在移植后監測患者的血藥濃度、健康狀況，以確保不會發生這些并發癥［1］。采用流式細胞術對淋巴細胞亞群測定，T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、輔助/誘導性T 淋巴細胞及抑制/細胞毒性T 淋巴細胞的百分比或絕對計數可用于表征和監測某些形式的免疫缺陷及自身免疫疾病。

由于CMV 對臨床預后的負面影響，腎移植后的預防是非常重要的治療措施。對于腎移植術后CMV 感染預防有兩大基本策略：抗病毒預防性治療和搶先治療。為了確保搶先治療的有效性，需要對移植患者進行定期（每周1 次）的CMV pp65 抗原等實驗室檢測，得到CMV 感染的早期證據從而獲得更好的長期生存率。因此，如何早期靈敏快速診斷CMV 感染對腎移植患者意義重大。本研究將自建的CMV pp65 抗原血癥檢測方法與CMV DNA 等方法進行比較，將CMV pp65 抗原血癥的檢測與CMV DNA 檢測結合，對臨床及時準確診斷CMV 感染具有一定意義。

3.1 CMV pp65 抗原血癥檢測與CMV IgG 抗體、IgM抗體及CMV DNA 結果討論：本研究對110 例腎移植后樣本進行CMV pp65 抗原血癥檢測的同時，對CMV IgG 抗體、IgM 抗體及CMV DNA 也進行檢測。

血清學檢測CMV IgG 抗體及IgM 抗體是用來證明CMV 感染最常用的方法。本實驗用化學發光定量檢測腎移植后110 例樣本的CMV IgG 抗體、IgM抗體，110 例樣本的IgM 抗體結果均為陰性，CMV IgM 抗體最初是在早期CMV 感染過程中分泌的，若通過血清學檢測法檢測到CMV IgM 抗體則表明是活躍，急性或近期感染，但由于腎移植病人應用免疫抑制劑，影響IgM 抗體檢測結果，IgM 抗體陽性率低，不適合做早期診斷的指標，本實驗IgM 抗體則不納入討論。兩種方法與IgG 抗體比較，CMV pp65與IgG 抗體同時陽性有62 例，同時陰性有1 例。CMV IgG、IgM 血清學檢測在診斷腎移植術后CMV病方面的作用有限，移植受者由于接受免疫抑制治療，CMV 感染后產生抗體的時效性和能力都會受到限制［13］。

CMV DNA 檢測是目前主要用于CMV 感染的檢測方法，通過實時熒光定量PCR 的方法定量分析CMV DNA 的表達情況，從而判斷巨細胞病毒感染的狀況。由于其高靈敏度和高通量，已成為首選的診斷測試方法。因此，它被廣泛地用于臨床診斷 CMV 疾病，確定何時開始先發性抗病毒治療以及監測CMV 感染和/或疾病進程［10-11］。在本研究對CMV pp65 抗原血癥與CMV DNA 結果比較，CMV pp65 抗原血癥檢測結果與CMV DNA 同時陰性有45 例，同時陽性有27 例。CMV pp65 抗原陽性、DNA 陰性的樣本，可能是由于CMV pp65抗原出現時間較DNA 出現早，DNA 未能及時檢出，也可能由于CMV DNA 檢測靈敏度不夠。CMV pp65 抗原陰性、DNA 陽性的樣本，可能是由于抗原血癥的檢測對白細胞數量有一定要求，而在顯微鏡下觀察有無陽性細胞存在操作者主觀因素的影響。

在研究過程中，其中1 例腎移植術后患者發熱原因不明，臨床排除細菌及真菌感染，多次全血CMV DNA 結果均為陰性，而該患者CMV pp65 抗原血癥陽性，提示CMV 感染導致的發熱不除外。經二代測序驗證，該患者檢出CMV 感染。予以抗病毒治療，臨床癥狀好轉。該案例反映CMV pp65 抗原血癥檢測能夠早期發現CMV 復制，對CMV 感染的早期診斷有較大價值。該案例也反映出目前全血CMV DNA 檢測可能存在靈敏度不足的問題。因此，將CMV pp65 抗原血癥的檢測與CMV DNA 檢測結合，對臨床及時準確診斷CMV 感染具有一定意義。

3.2 CMV pp65 抗原血癥檢測與肌酐、FK506 藥物濃度及淋巴細胞亞群等之間的相關性：CMV 感染與急性排斥反應和慢性同種異體移植損傷相關，包括在腎移植后患者中的慢性同種異體腎病［2，13］，肌酐、FK506 藥物濃度及淋巴細胞亞群是評估移植腎損傷的幾個有效指標。在本研究中，CMV pp65抗原血癥檢測結果與肌酐、FK506 藥物濃度差異不具有統計學意義，CMV pp65 抗原血癥在反映CMV 感染方面意義尚不明確。但不排除實驗操作直接影響統計結果：樣本數量收集不足導致統計結果有差異，患者是否能夠遵醫囑服藥、免疫抑制狀態下是否有其他病毒及細菌感染、患者移植術后的時間以及是否發生移植排斥反應等外源性因素都會干擾肌酐、FK506 結果從而直接影響統計結果。

細胞免疫的測定即對淋巴細胞亞群的數量和/或功能進行檢測，已成為一種臨床工具，可幫助SOT 后CMV 風險分層和管理［2，14］。在本研究中， CMV pp65 抗原血癥結果與NK 細胞絕對值差異具有統計學意義（P ＜0.05），CMV pp65 抗原血癥陽性的樣本NK 細胞絕對值均低于pp65 陰性的樣本。NK 細胞絕對值一定程度上可以用來評估CMV感染。

4 結 論

CMV pp65 抗原血癥檢測與CMV IgG 抗體結果比較不具有統計學意義。CMV pp65 抗原與CMV DNA 結果一致性為65.5%，兩種方法聯合檢測，對提高CMV 感染臨床診斷準確率具有一定意義。

在CMV pp65 抗原陰性組與陽性組中，血清肌酐水平、全血FK506 藥物濃度兩組間差異無統計學意義。

在CMV pp65 抗原陰性組與陽性組中，NK 細胞絕對值差異具有統計學意義，NK 細胞絕對值偏高的腎移植患者，發生CMV 感染的概率偏低。