循環(huán)腫瘤DNA檢測在人乳頭瘤病毒相關(guān)性宮頸癌中的應(yīng)用與展望

江寶妮 張美琴 楊露 陳致遠 韓娜娜

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)醫(yī)學(xué)中心 （廣州 510280）

循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是由腫瘤細胞主動分泌或腫瘤細胞壞死或凋亡過程中釋放的片段化無細胞狀態(tài)DNA，長度在132 ～145 bp，半衰期一般不超過2 h，大多存在于血漿或血清中，由雙鏈或單鏈DNA 混合而成，可直接反映腫瘤相關(guān)信息［1］。有研究［2］表明，癌癥早期ctDNA的含量極低，而晚期腫瘤在血液中釋放的ctDNA明顯增加。

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是屬于乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病毒屬的一組球形、微小、無包膜的環(huán)狀雙鏈DNA 病毒。其中，高危型HPV 長期感染是諸多婦科惡性腫瘤的重要病因，與約99.7%的宮頸癌［3］、29% ～ 43%的外陰癌、70%陰道癌［4］相關(guān)，HPV-DNA 整合到宿主基因組中，通常每個細胞以多個拷貝存在，因此也以ctDNA 的形式釋放。

基于ctDNA 檢測技術(shù)的出現(xiàn)和更新，為HPV相關(guān)性婦科惡性腫瘤的病程監(jiān)測提供了一種新的選擇。本綜述主要總結(jié)了HPV-ctDNA 在宮頸癌中的應(yīng)用，進而討論HPV-ctDNA 在其他HPV 相關(guān)性婦科惡性腫瘤中應(yīng)用的可能及前景。

1 ctDNA 與HPV 相關(guān)性宮頸癌

1.1 ctDNA 檢測在HPV 相關(guān)型宮頸癌中應(yīng)用的可行性絕大多數(shù)宮頸癌與HPV 相關(guān)。HPV 基因組編碼6 種主要影響病毒基因調(diào)控及細胞轉(zhuǎn)化的早期（E）蛋白，2 種影響病毒衣殼形成的晚期（L）蛋白的DNA 序列和一段稱為上游控制區(qū)或長控制區(qū)的DNA調(diào)控序列。E6和E7蛋白分別結(jié)合P53和pRb蛋白，使腫瘤抑制蛋白顯著減少，引起上皮細胞永生化。因此，E6、E7基因成為研究中的熱點。

HPV 基因大多與宿主細胞的基因組發(fā)生整合，形成特異性的病毒-細胞DNA 連接，已有研究證實這種特異性連接可以通過不同的PCR 技術(shù)在HPV 相關(guān)型宮頸癌患者血漿中檢測出［5-6］。瑞典卡羅林斯卡學(xué)院SIVARS 等［7］總結(jié)了近22 年的研究，發(fā)現(xiàn)HPV-ctDNA 在HPV 陽性的浸潤性宮頸癌治療前患者血液樣本中是可檢測到的，而在HPV 陽性的宮頸癌前病變及無宮頸病變?nèi)巳褐委熐把簶颖局袠O少檢測到HPV-ctDNA，特別是在2016 年后進行的研究中均無檢測到HPV-ctDNA 記錄。因此，HPV-ctDNA 可作為浸潤性宮頸癌特異性生物標(biāo)志物是具有可行性的。

表1 近5 年浸潤性宮頸癌的HPV-ctDNA 研究匯總Tab.1 Studies investigating detection of HPV-ctDNA from patient with invasive cervical cancer in the last five years

1.2 ctDNA 在HPV 相關(guān)性宮頸癌中的應(yīng)用

1.2.1 常規(guī)隨訪手段及其局限大多數(shù)婦科惡性腫瘤患者在治療結(jié)束5 年內(nèi)，前2 年內(nèi)每3 ～ 6 個月復(fù)查1 次，隨后每6 ～ 12 個月復(fù)查1 次。隨訪內(nèi)容包括復(fù)發(fā)或治療不良反應(yīng)相關(guān)的癥狀回顧，以及全面的臨床檢查。影像學(xué)需待腫瘤達到一定體積后才能檢測出，存在滯后性，且因輻射等原因不能實時監(jiān)測；血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物間接反映腫瘤狀態(tài)，不能直接提供腫瘤進展信息，與病理相關(guān)性差，敏感性和特異性較低；病理學(xué)組織活檢、免疫組化等需穿刺活檢或手術(shù)后才能獲得腫瘤組織，因此取材困難，亦不能作為實時監(jiān)測手段。

1.2.2 ctDNA 檢測技術(shù)的應(yīng)用ctDNA 會攜帶來源于腫瘤細胞相關(guān)的遺傳學(xué)特征，如基因突變、甲基化、擴增或重排等，在為腫瘤篩查、診斷、治療療效評估及預(yù)后風(fēng)險分層等腫瘤全病程管理中顯露獨特優(yōu)越性［13］。

實體瘤ctDNA 檢測技術(shù)主要有兩類：一類基于PCR 分析技術(shù)，以三代的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）為代表，將復(fù)雜的混合物中單個靶向序列分隔入獨立單元進行檢測，實現(xiàn)了在單個分子水平上定量檢測腫瘤基因突變的罕見事件，檢測的靈敏度達到0.001%；第二類是基于高通量測序技術(shù)，較具代表性技術(shù)為腫瘤個體分析深度測序法（CAncer Personalized Profiling by deep SEQuencing，CAPP-Seq），其平均測序深度達23 570×，將檢出分子突變信息結(jié)合基因組捕獲區(qū)域的基因拷貝數(shù)變異等信息納入評估模型［14］。

目前ctDNA 檢測的主要策略有兩種：其一，腫瘤知情分析（Tumor-informed assays）即先對原發(fā)腫瘤組織進行測序，找到特異性基因組突變位點，以定制多重PCR-NGS 面板，實現(xiàn)個性化ctDNA 檢測分析；其二，腫瘤未知分析（Tumor agnostic assays），與前者不同的是，該策略不需要檢測原發(fā)腫瘤組織，而通過某特定癌種的已知突變基因來預(yù)先選定引物或探針，設(shè)計與該癌種相關(guān)的固定面板進行檢測及分析。

1.2.3 ctDNA 檢測的優(yōu)勢ctDNA 檢測為代表的液體活檢具有微創(chuàng)，可反復(fù)取材，收集、處理和分析報告周轉(zhuǎn)時間短等優(yōu)勢［13］。其中，HPV-ctDNA檢出水平可評估治療療效，且與宮頸癌預(yù)后相關(guān)，受多種因素影響。有研究［15］發(fā)現(xiàn)治療反應(yīng)與ctDNA檢測之間存在顯著相關(guān)性，這表明ctDNA 有機會作為治療療效的生物標(biāo)志物和該患者群體復(fù)發(fā)的預(yù)測因子；定量研究顯示，采用ddPCR 方法，宮頸癌患者HPV-ctDNA 水平與臨床分期和腫瘤大小有關(guān)，范圍為（55 ± 85）拷貝/mL（Ⅰ期）至（1 774 ±3 676）拷貝/mL（Ⅳ期）；即使在亞臨床階段，HPV 相關(guān)侵襲性癌癥患者的血漿中也可檢出HPV-ctDNA，其水平與腫瘤動態(tài)有關(guān)［16］。HPV-ctDNA 在晚期宮頸癌患者中更容易檢測到，特別是在存在淋巴血管浸潤、深層間質(zhì)侵犯、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)及腫瘤負荷大等的情況下［8］，與不良預(yù)后相關(guān)。在一些前瞻性研究中，大多數(shù)患者在治療結(jié)束時HPV-ctDNA均被清除，而完成放化療后血清中持續(xù)存在HPVctDNA 的患者獲得較低的無病生存期（P= 0.048）和總生存期（P= 0.001 3）［11］；從檢測到HPV-ctDNA到復(fù)發(fā)，中位時間為10 個月，因此，HPV-ctDNA 可以作為治療結(jié)束時的殘留腫瘤標(biāo)志物及預(yù)測隨訪期間復(fù)發(fā)的生物學(xué)指標(biāo)［10，12］。

1.3 ctDNA 檢測在HPV 相關(guān)性宮頸癌中應(yīng)用的局限影響檢測的因素包括HPV-ctDNA 的水平及檢測手段。經(jīng)計算，每3 mL 血液可產(chǎn)生1 mL 血漿，包含6 ng 無細胞DNA（cfDNA），即血液中游離的DNA，則理論上相當(dāng)于每毫升血漿里含有多達2 000 個總的cfDNA 拷貝［17］。其中，85%的cfDNA來自血細胞，10%來自血管內(nèi)皮細胞，1%來自肝細胞，剩余的來自包括癌細胞在內(nèi)的其他細胞［18］。并且，身體里炎癥、手術(shù)、組織損傷或使用化療藥物，甚至年齡、高強度運動，以及肝腎功能降解代謝強弱、核酸酶活性等因素，都可能改變cfDNA 在體內(nèi)的水平［19］。因此，在強大的基因背景下找到特定的基因事件需要更精確的檢測手段的支持。但檢測的特異度和靈敏度是ctDNA 能否應(yīng)用于臨床的兩個關(guān)鍵點，較低的靈敏度會阻礙ctDNA 檢測發(fā)展，反之，高靈敏度帶來的高假陽性會帶給患者嚴(yán)重的心理負擔(dān)。

1.4 ctDNA 檢測在HPV 相關(guān)性宮頸癌中應(yīng)用的展望世界衛(wèi)生組織早在2020 年提出了一個“70%”的目標(biāo)，即有70%的女性能夠在45 歲之前接受高效宮頸癌篩查［20］。目前公認使用的高危型HPV 檢測方法均無法區(qū)分一過性感染和持續(xù)性感染［21］。在廣東，全省宮頸癌篩查檢出率為56.50/10 萬，早期診斷率為94.15%［22］，ctDNA 檢測技術(shù)的更新，能否將應(yīng)用階段提前，達到早期診斷的目的，成為了研究的熱點。

短暫的HPV感染可能導(dǎo)致循環(huán)HPV-DNA產(chǎn)生并非完全不可能，但檢出率極低，在高危地區(qū)健康女性中檢出循環(huán)HPV-DNA 的概率為0 ～ 2%［7］。因此，HPV 陽性宮頸病變高危人群的血清中若可檢出HPV-ctDNA，則可作為宮頸癌早期診斷的參考。隨著ddPCR 技術(shù)的出現(xiàn)及應(yīng)用，HPV 陽性浸潤性宮頸癌局部晚期及晚期（ⅠB3-ⅣB）患者血漿中HPV-ctDNA 檢出率為63.3% ～ 94.4%，而早期患者檢出率僅為10% ～ 26.7%［8-9］。早期宮頸癌HPVctDNA 含量低，檢出率也低，容易出現(xiàn)假陰性［23］。Luisa Galati 在最新的研究中介紹了一種檢測方法——基于珠狀HPV 基因分型試驗（E7 型特異性多重基因分型試驗［E7-MPG］），并將其與ddPCR 檢測和HPV16 E6 抗體檢測進行比較，E7-MPG 檢測HPV16 陽性宮頸癌的敏感性高于ddPCR（74.7%vs63.1%；P＜ 0.001）；另外，在此驗證試驗中還發(fā)現(xiàn)E6 抗體主要出現(xiàn)在宮頸癌早期，而HPV-ctDNA 主要出現(xiàn)在腫瘤晚期［24］。新檢測技術(shù)的出現(xiàn)為推動宮頸癌疾病早期診斷提供了強有力的支持，但檢測準(zhǔn)確性及特異性的提高依然是難題。

另外，實現(xiàn)利用HPV-ctDNA 檢測宮頸癌假定的治療靶點，制定個性化診療方案，探求化療耐藥的分子證據(jù)，亦或是在無法通過傳統(tǒng)手段診斷的地區(qū)進行疾病篩查，則可大大減輕宮頸癌篩查及治療靶點檢測的負擔(dān)，實現(xiàn)應(yīng)用統(tǒng)一評價指標(biāo)完成對HPV 陽性宮頸癌患者全病程的有效管理。

1.5 ctDNA 在HPV 相關(guān)性外陰癌及陰道癌在婦科惡性腫瘤中與HPV 感染關(guān)系密切的除了宮頸癌，還有外陰癌及陰道癌。據(jù)統(tǒng)計，外陰癌有接近四成與HPV 相關(guān)，其中，以鱗狀細胞癌最為多見，常發(fā)生于年輕女性，與性危險因素相關(guān)，通常表現(xiàn)為多灶性，與經(jīng)典的外陰上皮內(nèi)瘤變相關(guān)，可并發(fā)下生殖道其他部位的鱗狀上皮病變［25］。一項薈萃分析提示，HPV 陽性外陰癌的女性具有更高的生存率［26］，這與發(fā)病年齡更年輕、病因較為明確以及存在更多可檢測到的基因靶點相關(guān)。而陰道癌的發(fā)生發(fā)展與HPV 感染更關(guān)系更為密切［4］。

相似的病因，常伴以相似的特點。HPV 相關(guān)的惡性腫瘤是HPV-ctDNA 作為生物標(biāo)志物的特異性模型［27］，而HPV 相關(guān)婦科惡性腫瘤以其特殊人群類型、發(fā)病部位以及組織結(jié)構(gòu)是否也可構(gòu)成新的疾病模型，以求統(tǒng)一覆蓋早期癌癥檢測、分子分型、治療期診療方案選擇、療效評價、用藥指導(dǎo)及隨訪期預(yù)后評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測的及時且有效的評價指標(biāo)，更好規(guī)范臨床診療。

2 總結(jié)與展望

目前，液體活檢中ctDNA 檢測已應(yīng)用于各類實體腫瘤，被非小細胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等的相關(guān)診療指南納入，但在婦科腫瘤中的研究仍在起步階段。而HPV-ctDNA 可作為一把鑰匙，優(yōu)先打開HPV 相關(guān)性婦科惡性腫瘤液體活檢的大門，逐步完成從預(yù)測復(fù)發(fā)到早診優(yōu)治，從單病程到全病程，甚至從某些癌種到全癌種的個體化、規(guī)范化管理的跨越。

【Author contributions】JIANG Baoni performed the Searched literature and wrote the article. ZHANG Meiqin performed the Searched literature. YANG Lu and CHEN Zhiyuan revised the article. HAN Nana designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.