m6A甲基化修飾在急性腎損傷中的研究進展

唐立麗 王昕宇 張杰 趙悅 李小悅

遵義醫科大學第五附屬（珠海）醫院急診科、重癥醫學科（廣東珠海 519100 ）

急性腎損傷（acute kidney injury， AKI）是指各種病因引起短時間內腎功能快速減退的臨床綜合征，其發病機制復雜、治療策略有限，具有高發病率、高病死率、高治療費用及進展為慢性腎臟病的特點［1］。研究［2］顯示，超50%的ICU 患者發生過AKI，AKI 可使危重癥患者死亡率增加3 ～ 7 倍，每年導致約200 萬人死亡，約25%的AKI 患者需接受腎臟替代治療。然而現有醫學領域對AKI 的機制認知尚淺，深入探索其病理生理機制、尋找臨床治療的潛在靶點，對改善AKI 患者預后、減輕社會經濟負擔具有重要意義。N6-甲基腺嘌呤（m6A）甲基化廣泛存在于mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等編碼和非編碼RNA 中，通過調控表觀遺傳修飾參與多種生物學過程和疾病發生［3］。近年研究表明m6A 甲基化修飾在AKI 的發生發展中發揮重要調節作用，有望成為治療AKI 的有效靶點。本文就m6A 在AKI 中的作用及未來可能的研究方向進行綜述，以期為研究AKI 表觀轉錄組的調控作用和研發新的臨床治療藥物提供一定參考依據。

1 m6A 甲基化修飾

m6A 甲基化修飾指RNA 腺苷酸第六個氮原子的甲基化，是真核生物中最常見的RNA 修飾，占所有RNA甲基化的80%以上，多富集于3′編碼區、長外顯子區或接近終止密碼子的RRACH（R=A，G； H=U， C， A）序列中［3］。自1974年首次報道哺乳動物的mRNA 存在m6A 修飾、1978 年證明m6A 促進mRNA 降解以及1997 年克隆并發現甲基轉移酶樣蛋白3（Methyltransferase-like Protein 3， METTL3）后，人們對m6 A 介導的轉錄后調控及其與疾病的關系進行了廣泛探索。m6A 作為RNA 命運的主宰因素，通過m6A 甲基轉移酶、去甲基化酶和閱讀蛋白動態可逆地調控RNA 的剪接、出核、翻譯、穩定性和高級結構，與生命的發育、代謝、免疫以及腫瘤等多種疾病的發生息息相關。

2 m6A 調控蛋白

m6A 三大調控蛋白動態互作形成“m6A 開關”靶控目標RNA 命運。甲基轉移酶（Writer）識別目標RNA 并寫入甲基化修飾，去甲基化酶（Eraser）可擦除甲基化，閱讀蛋白（Reader）特異性結合m6A 位點、發揮轉錄后調控功能。 m6A 的修飾與擦除主要發生在細胞核，m6A 閱讀發生在細胞核和細胞質中。

2.1 m6A 甲基轉移酶m6A 修飾通過m6A 甲基轉移酶復合物（Methyltransferase Complex， MTC）催化介導，MTC 由催化亞基（METTL3/14）和調控亞基（Wilm′s 腫瘤1 相關蛋白（WTAP）、Vir 樣m6A 相關甲基轉移酶（VIRMA）、含鋅指CCCH 型13（ZC3H13）、RNA 結合域蛋白15（RBM15）等）組成，呈“戰馬形”拓撲結構［4］。METTL3 結合甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine， SAM）、直接催化m6A 修飾，METTL14 識別并結合目標RNA、變構激活和增強METTL3 催化活性，METTL3-METTL14 異二聚體組成MTC 的催化亞基［5］。調控亞基可調節催化亞基活性、RNA結合能力與區域選擇性。WTAP和VIRMA組成調控亞基的核心結構。WTAP 招募并引導催化亞基核定位，與METTL3 結合穩定MTC 結構［6］。VIRMA 充當支架蛋白并介導3′編碼區優先甲基化。ZC3H13 增強催化亞基活性和RNA 結合能力，與VIRMA 結合后作為橋梁連接RBM15，擴展調控亞基構象［4］。RBM15 是一種具有三個RNA 識別基序的接頭蛋白，招募并促進MTC 結合目標RNA［7］。此外，少數特定底物RNA 的m6A 修飾由METTL16、METTL5 和ZCCHC4介導［8］。

2.2 m6A 去甲基化酶m6A 修飾系統的動態可逆性由去甲基化酶調控。目前已知的去甲基化酶包括脂肪和肥胖相關蛋白（Fat-mass and Obesityassociated Protein， FTO）、ALKB 同源蛋白5（AlkB Homolog 5， ALKBH5）與ALKBH3，三者均為α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶alkb 樣超家族成員，以2-氧戊二酸、二價鐵和氧分子為底物催化目標甲基發生羥基化，形成羥甲基后脫離氮原子完成去甲基化［9］。FTO 是首個被鑒定的去甲基化酶，可去除多種RNA 和DNA 上的甲基化修飾［10］。ALKBH5在腎臟中高表達，對mRNA 具有高效的脫甲基活性，參與核內mRNA 的輸出和加工［11］。新型去甲基化酶ALKBH3 僅對tRNAs 具有底物特異性［12］。

2.3 m6A 閱讀蛋白閱讀蛋白識別修飾后的m6A 位點、調控修飾RNA 的生物學功能。YTH 結構域家族蛋白（YTHDF1/2/3、YTHDC1/2）、胰島素樣生長因子2-mRNA 結合蛋白1-3（IGF2BP1/2/3）、異質核糖核蛋白家族（hnRNPA2B1、hnRNPC、hnRNPG）、真核起始因子3（eIF3）是最主要的閱讀蛋白。YTHDF1/2/3 是第一組被發現的胞質m6A閱讀蛋白，YTHDF1 促進mRNA 翻譯，YTHDF2 加速mRNA 降解，YTHDF3 與YTHDF1 和YTHDF2 相互作用增強翻譯和降解［13-14］。YTHDC1 位于細胞核內，促進pre-RNA 的選擇性剪接和mRNA 的核輸出［15］。YTHDC2 在睪丸中高度表達，是一種RNA 解旋酶，參與調節mRNA 翻譯或降解［16］。IGF2BP 1/2/3 可維持mRNA 穩定性以及調控mRNA 選擇性剪接［17］。hnRNPs 家族均位于細胞核內，hnRNPA2B1 調節mRNA 剪接和microRNA 成熟［18］，hnRNPC 和hnRNPG 調節m6A 修飾轉錄本的加工［19］。eIF3 可結合5'UTR m6A 位點以不依賴帽的方式啟動蛋白質翻譯［20］。

3 m6A 在AKI 中的生物學功能

現有研究表明m6A 修飾在AKI 的發生發展中發揮重要調節作用，干預m6A 修飾機制可影響AKI 的轉歸，靶向調控m6A 有望成為治療AKI 的有效靶點［21］。

3.1 m6A 與膿毒癥性急性腎損傷膿毒癥性急性腎損傷（septic acute kidney injury， SAKI）是ICU患者急性腎損傷的首要原因，占比超過50%，與住院時間延長、進展為慢性腎臟病和高病死率均相關［22］。目前研究表明SAKI 的多個調控機制異常均與m6A 失調相關。LIU 等［23］通過對盲腸結扎穿刺和對照組小鼠腎組織進行RNA 測序及富集分析發現，m6A 調控蛋白與兩組間重要樞紐差異基因（鐵死亡、細胞凋亡、PI3K-Akt、NF-Kappa B 和IL-17 等炎癥信號通路）存在密切互作，其中m6A 調控蛋白對鐵死亡相關mmu-miR-7212-5p/Hmox1 軸的調控機制可能具有治療SAKI 的潛在臨床意義。

3.1.1 m6A 甲基轉移酶與SAKIMETTL3 是導致SAKI 發生m6A 失調的關鍵調控蛋白。多個研究均發現METTL3 在SAKI 模型中表達上調，遺傳和藥理抑制METTL3 可明顯減輕SAKI 腎臟損傷和炎癥反應［24-26］。METTL3 以m6A 依賴方式促進IGF2BP2結合并增強TGF-β 活化激酶1 結合蛋白（TGF-β-activated Kinase 1 Binding Protein 3， TAB 3）mRNA穩定性與表達，加重SAKI 小鼠腎臟炎癥反應和程序性細胞死亡［24］。METTL3 同時可促進mmu-long非編碼RNA121686 表達，通過海綿吸附miR-328-5p 解除其對高溫需要因子A3（High Temperature Requirement Factor A3， HtrA3）的翻譯抑制，誘導SAKI 小鼠腎小管上皮細胞凋亡［25］。METTL3 還通過m6A 修飾促進YTHDF1 介導的E3 泛素連接酶小鼠雙微體基因（Murine Double Minute 2， MDM2）翻譯及表達，誘導抑癌基因p53 泛素化，繼而激活核纖層蛋白B1（Lamin B1， LMNB1）加重SAKI 小鼠腎小管上皮細胞線粒體損傷和鐵死亡［26］。目前針對METTL3 抑制劑的研發尚處于起步階段，干預METTL3 在SAKI 的治療中具有極大發展空間。

3.1.2 m6A 去甲基化酶與SAKIm6A 去甲基化酶在SAKI 中的機制研究相對較少。研究發現右美托咪定可逆轉SAKI 細胞模型的ALKBH5 表達上調，通過促進肺癌轉移相關轉錄本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）mRNA 的m6A 修飾抑制MALAT1 表達，從而影響人腎臟近端小管上皮（HK-2）細胞活力、誘導細胞凋亡、抑制炎癥細胞因子產生，改善腎功能［27］。最新研究發現，RNA 結合蛋白RBM33 可招募并解除ALKBH5 的類泛素化修飾、激活其去甲基化酶活性［28］，這一機制可能為靶向調控ALKBH5以治療SAKI 提供有效策略及新靶點。

3.1.3 m6A 閱讀蛋白與SAKI閱讀蛋白是m6A調控系統的最終執行者，甲基轉移酶在SAKI 中介導的m6A 修飾均需依賴閱讀蛋白發揮生物學功能。IGF2BP1 識別m6A 修飾直接上調E2F 轉錄因子1（E2F Transcription Factor 1， E2F1）表達，促進NLRP3 炎性小體的亞基巨噬細胞遷移抑制因子（Macrophage Migration Inhibitory Factor， MIF）轉錄翻譯，誘導SAKI 小鼠腎小管上皮細胞焦亡［29］。膿毒癥患者及膿毒癥小鼠的YTHDF1 表達下調，過表達YTHDF1 可以m6A 依賴方式促進含有E3 泛素蛋白連接酶1（WW Domain Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase 1， WWP1）翻譯，引起炎癥小體NLRP3 泛素化、抑制半胱天冬酶-1（Caspase-1）依賴性焦亡來緩解腎損傷［30］。

3.2 m6A 與缺血再灌注腎損傷缺血再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）腎損傷是指腎臟在缺血基礎上恢復血流后組織損傷反而加重甚至出現不可逆的損傷現象，易導致慢性腎纖維化，在腎移植術后、老年人和糖尿病患者中常見［31］。缺血再灌注腎損傷的病理生理機制至今尚未完全闡明，現有研究發現m6A 失調可能通過調控細胞凋亡、免疫調節、自噬、纖維化等多重機制加重I/R 腎損傷［32］。

3.3 m6A 甲基轉移酶與I/R-AKII/R-AKI 患者腎組織和小鼠模型中的METTL3、METTL14 等甲基轉移酶表達升高。METTL3 表達水平與I/R-AKI小鼠的腎臟損傷程度直接相關，抑制或沉默METTL3 可改善I/R 誘導的腎損傷和細胞凋亡，RNA 免疫共沉淀測序結果表明METTL3 上調叉頭盒D1（Foxd1）mRNA 的m6A 修飾水平，繼而誘導I/R 模型細胞凋亡、加重腎損傷［33］。METTL14 的表達水平與I/R-AKI 患者的血清肌酐水平呈正相關，I/R-AKI 模型實驗提示METTL14 可直接靶向增強Yes 相關蛋白1（YAP1）m6A 修飾，YTHDF1 識別m6A 修飾位點后特異性結合并促進YAP mRNA 翻譯與表達，誘導腎小管間質纖維化和異常分化、加速I/R 小鼠模型腎纖維化的進展［34，35］。

3.4 m6A 去甲基化酶與I/R-AKI去甲基化轉移酶在I/R-AKI 中的調控作用尚存爭議。熊冰瑤等人的研究結果顯示I/R-AKI 細胞模型的去甲基化酶FTO 表達下調、m6A 修飾水平上升，FTO 介導的RNA m6A 修飾可能通過抑制HK-2 細胞凋亡減輕腎損傷［36］。不同的是ZHUANG 等［37］研究發現FTO可去除過氧化物酶體增殖體激活受體γ 輔助激活因子1-α（Peroxisome Proliferator Activating Receptor γ Coactivator 1-α， PGC-1α）mRNA 的m6A 修飾，增加PGC-1α mRNA 穩定性及表達，以恢復線粒體活性、誘導氧化應激和ROS 產生，而氧化應激是介導I/R 腎小管壞死和腎功能障礙的主要機制。此外，卡格列凈被發現可抑制I/R 模型去甲基化酶FTO 表達，促進自噬相關受體SQSTM1 mRNA 的m6A 修飾與表達、誘導自噬體形成，預防腎小管細胞腎纖維化［38］。還有研究顯示，ALKBH5 抑制劑IOX1 可促進CC 趨化因子配體28（CC Chemokine Ligand 28， CCL28）mRNA 的m6A 修飾、增強其穩定性，從而促進調節性T 細胞分化、調節Treg/炎癥細胞軸，減輕I/R 腎損傷；該作者還發現ALKBH5在I/R 小鼠腎組織中的表達具有時效性，其在造模后12 h 表達下降，24 ～ 48 h 急劇上升，120 h 恢復至正常［39］。m6A 修飾在AKI 中的不同作用可能與調控蛋白的功能具有多面性以及調控蛋白表達隨AKI 的發病時間而變化等因素相關，其具體機理仍需更多研究進一步挖掘。

3.5 m6A 與腎毒性藥物相關急性腎損傷腎毒性藥物暴露是急性腎損傷的重要原因之一，約25%的AKI 病例由腎毒性藥物暴露所導致［40］。順鉑所致急性腎損傷是腫瘤患者化療的常見并發癥［41］。研究發現順鉑治療可改變腎臟中的m6A修飾譜。與對照組相比，順鉑誘導的AKI 小鼠METTL3 和ALKBH5 表達升高、FTO 表達降低、m6A修飾總水平上調，兩組間存在多個顯著甲基化差異基因，主要富集于代謝和細胞死亡通路［42］。過表達FTO 可降低p53 mRNA 的m6A 修飾水平、下調p53 表達，逆轉順鉑誘導的HK2 細胞凋亡和腎功能損傷［43］。此外，m6A 轉錄圖譜分析提示致癌物質鎘（Cadmium， Cd）所致急性腎損傷模型m6A 水平和m6A 調控蛋白表達均上調，m6A 可能通過調控炎癥和代謝相關基因影響Cd誘導的腎損傷［44］。有研究觀察到在黏菌素所致AKI 模型中，METTL3 表達下降導致m6A 失調，過表達METTL3 可以m6A依賴方式促進miR-873-5p pre-mRNA 的剪接和成熟，miR-873-5p 可上調Nrf2/HO-1 表達以對抗黏菌素誘導的氧化應激和細胞凋亡［45］。

4 展望與未來

作為RNA 中最普遍的修飾，m6A 將表觀轉錄組學與AKI 的發生發展相聯系，影響腎臟的炎癥反應、程序性細胞死亡、代謝、氧化應激、修復等過程，因此m6A 修飾調控蛋白有望成為AKI 診治和藥物開發的潛在分子靶標。臨床研究發現尿m6A調控蛋白在糖尿病腎病患者中顯著降低并隨腎功能惡化而下降［46］，m6A 調控蛋白能否作為AKI 的早期診斷及病情嚴重程度評估標志物的臨床應用也極具潛力。目前AKI 中m6A 修飾的研究仍處于早期階段并且具有爭議，m6A 失調似乎起“雙刃劍”作用，可能與m6A 修飾在表達上具有時效性、功能上具有多面性和可調節性相關。同時m6A 修飾的上游調控機制及m6A 修飾介導的RNA 與DNA 之間的串擾作用在AKI 中的影響尚不明確，目前仍需進一步研究為急性腎損傷的發生發展提供深入見解。

【Author contributions】TANG Lili consulted relevant references and wrote the article. WANG Xinyu and ZHANG Jie revised the article； ZHAO Yue and LI Xiaoyue reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.