防風(fēng)氣味與化學(xué)成分相關(guān)性研究

魏麗紅，常福瑞，閆 爽，郝德國，于東輝，王冬梅，劉曉秋，潘英妮

（沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽市中藥藥效物質(zhì)研究與創(chuàng)新藥開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016）

防風(fēng)來源于傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata（Turcz.） Schischk.的干燥根，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙等功效，現(xiàn)代臨床多用于治療感冒、頭痛、風(fēng)濕痹痛等［1］。氣味是中藥材質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)，中藥傳統(tǒng)性狀鑒別多以人的感官鑒別為主，具有一定的主觀性和經(jīng)驗(yàn)性，鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較差。電子鼻技術(shù)實(shí)現(xiàn)了特征性氣味的檢測，電子鼻也稱人工嗅覺系統(tǒng)，是模擬動物嗅覺器官開發(fā)出的高科技產(chǎn)品，其主要工作機(jī)制是陣列中的每個(gè)傳感器對不同被測氣體的靈敏度不同，不同氣體在不同傳感器上產(chǎn)生的響應(yīng)高低不同，最終形成傳感器陣列對不同氣體的響應(yīng)圖譜［2］。目前，電子鼻技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境控制、鑒別中藥材的真?zhèn)巍a(chǎn)地等［3-8］。與2020 年版《中國藥典》 中防風(fēng)性狀描述一致的是野生防風(fēng)，由于防風(fēng)臨床療效良好，需求量大，導(dǎo)致野生防風(fēng)資源匱乏。目前市場上流通的主要是栽培品，也常見野生防風(fēng)中混有抽薹防風(fēng)，而藥典規(guī)定抽薹防風(fēng)不可藥用，臨床對栽培防風(fēng)的認(rèn)可度也不高［9］。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，藥物形態(tài)、顏色、氣味、質(zhì)地與藥性相關(guān)，性狀是決定藥性的主要因素［10］。本實(shí)驗(yàn)從氣味出發(fā)，借助電子鼻對不同防風(fēng)粉末的整體氣味進(jìn)行客觀化表達(dá)，探究不同生長方式防風(fēng)的氣味與化學(xué)成分間的相關(guān)性及栽培防風(fēng)、抽薹防風(fēng)與野生防風(fēng)的區(qū)別。

1 材料

1.1 儀器 PEN 型電子鼻（北京盈盛恒泰科技有限公司）； FW100 型粉碎機(jī)、DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）； LC-20AB 型高效液相色譜儀，配置SPD-20AUV 型檢測器、LC-Solution 型色譜工作站（日本島津公司）； TGL-16B 型高速離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）； 2600-UV/VIS 型紫外分光光度計(jì)［尤尼柯（上海）儀器有限公司］。

1.2 試劑 升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷對照品（純度≥98%，成都普菲德生物有限公司）。95%硫酸、蒽酮（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。甲醇、甲酸為色譜純（天津市康科德科技有限公司）； 乙酸乙酯為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 藥材 防風(fēng)共15 批，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)潘英妮教授鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根，具體見表1。

表1 樣品信息

2 揮發(fā)油含量測定

按照2020 年版《中國藥典》 四部2204 項(xiàng)下方法操作，分別取栽培防風(fēng)、野生防風(fēng)、抽薹防風(fēng)各50 g，粉碎，過60 目篩備用。將粉碎好的藥材置圓底燒瓶中，加10 倍量純凈水和一定量的沸石，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使其充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶為止，圓底燒瓶置于電熱套加熱至沸騰并保持微沸至測定器中油量不再增加（約5 h），停止加熱，放置片刻，開啟測定器的下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)零刻度線上方5 mm 處為止，放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與零刻度線平齊，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算揮發(fā)油含量。

3 多糖含量測定

3.1 對照品溶液制備 取無水葡萄糖對照品25 mg，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，蒸餾水定容至刻度，即得含1.084 mg/mL 葡萄糖的貯備溶液。取2.5 mL 至25 mL 量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.108 4 mg/mL 的對照品溶液。

3.2 供試品溶液制備 精密稱取野生防風(fēng)、栽培防風(fēng)、抽薹防風(fēng)粉末各0.5 g，置于50 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 95%乙醇回流提取2 次，每次1 h，過濾，棄去濾液，回收濾渣，濾渣揮干溶劑后加25 mL 蒸餾水回流2 次，每次1 h，合并2 次提取液，轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，加水定容至刻度，取1 mL，置于50 mL 量瓶中，加水定容至刻度，即得。

3.3 蒽酮-濃硫酸試劑制備 精密稱取蒽酮粉末0.22 g，置于100 mL 棕色量瓶中，加80%濃硫酸溶解，定容至刻度，即得。

3.4 最大吸收波長的確定 吸取對照品、供試品溶液各1 mL，置于具塞試管中，冰水浴下分別緩慢加入0.2%的蒽酮-濃硫酸試劑4 mL，混勻，冷卻至室溫； 另取0.2%蒽酮-濃硫酸試劑4 mL，加入1 mL 蒸餾水，作為空白。將具塞試管置于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果，對照品、供試品溶液均在580 nm 處具有最大吸收，故選定其作為最大吸收波長，見圖1。

圖1 紫外全波長掃描圖

3.5 線性關(guān)系考察 分別吸取0.108 4 mg/mL 對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、0.9 mL，加蒸餾水至1 mL，在冰水浴中緩慢加入蒽酮-濃硫酸試劑4 mL 混勻，冷卻至室溫；另取蒸餾水1 mL，同法加入蒽酮-濃硫酸試劑4 mL 混勻，作為空白。將具塞試管置于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，于580 nm 波長處測定吸光度，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.007 9X＋0.008 8 （r＝0.999 3），在21.68～97.56 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.6 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（Y1） 0.5 g，按“3.4” 項(xiàng)下方法操作，在580 nm 波長處測定吸光度5 次，測得其RSD 為0.85%，表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（Y1） 0.5 g，按“3.4” 項(xiàng)下方法操作，分別于0、0.5、1.0、2.0、3.0 h 以水為空白，在580 nm 波長處測定吸光度，測得其RSD 為0.22%，表明溶液在3.0 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材（Y1） 5 份，按“3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以水為空白對照，按“3.4” 項(xiàng)下方法在580 nm 波長處測定吸光度，測得其RSD為1.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取總糖含量已知的樣品（Y1） 6 份，每份0.25 g，加入1.084 mg/mL 對照品溶液4 mL，按“3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以水為空白對照，按“3.4” 項(xiàng)下方法在580 nm 波長處測定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3.10 樣品含量測定 按“3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以水為空白對照，在580 nm 波長處測定吸光度，計(jì)算含量。

4 防風(fēng)整體氣味測定

4.1 傳感器信號分析 PEN 型電子鼻共有10 根金屬氧化物傳感器，具體如表3 所示。

表3 PEN 型電子鼻標(biāo)準(zhǔn)傳感器陣列與性能

4.2 樣品方法處理篩選 以樣品對傳感器響應(yīng)值為評價(jià)指標(biāo)，篩選稱樣量、孵化溫度、孵化時(shí)間。測量條件為手動進(jìn)樣，傳感器清洗時(shí)間80 s，測定時(shí)間60 s，采樣時(shí)間15 s。

4.3 稱樣量 取過40 目篩樣品，分別精密稱取0.3、0.6、1.0、1.5 g 后測定傳感器響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)1.0 g 時(shí)響應(yīng)值最高，并且各稱樣量無明顯差異，故確定稱樣量為1.0 g。

4.4 孵化溫度 精密稱取過40 目篩的樣品1.0 g，分別置于35、45、60 ℃水浴加熱40 min 后測定傳感器響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)在60 ℃時(shí)響應(yīng)值最高，故確定孵化溫度為60 ℃。

4.5 孵化時(shí)間 精密稱取過40 目篩的樣品1.0 g，分別置于60 ℃水浴中孵化20、30、40 min 后測定傳感器響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)在30 min 時(shí)響應(yīng)值最高，故確定孵化時(shí)間為30 min。

4.6 分析條件 采用直接頂空吸氣法，直接將進(jìn)樣針頭插入含樣品的進(jìn)樣瓶中吸氣，測定條件為室溫（22±2）℃，采樣時(shí)間每組15 s，傳感器自清洗時(shí)間10 s，分析采樣時(shí)間60 s，每批樣品連續(xù)測量2 次。以采樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，傳感器響應(yīng)電壓為縱坐標(biāo)繪制響應(yīng)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 防風(fēng)對電子鼻的響應(yīng)曲線

4.7 精密度試驗(yàn) 取樣品適量，測定10 個(gè)傳感器響應(yīng)值，重復(fù)5 次，測得其RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

4.8 樣品分析 取樣品適量，在“4.6” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，平行3 次，取平均值。

5 結(jié)果

5.1 色原酮、揮發(fā)油、多糖含量與電子鼻傳感器響應(yīng)值 15批樣品中色原酮（升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷）、揮發(fā)油、多糖含量測定結(jié)果見表4，電子鼻不同傳感器響應(yīng)值結(jié)果見表5，可知野生防風(fēng)各組響應(yīng)值波動均大于栽培防風(fēng)和抽薹防風(fēng)，表明前者氣味較濃郁。

表4 防風(fēng)中主要成分含量測定結(jié)果（%）

表5 防風(fēng)氣味響應(yīng)值測定結(jié)果

5.2 傳感器分析 Loading 分析是針對電子鼻傳感器的分析，可準(zhǔn)確計(jì)算出10 根傳感器的敏感成分信息及區(qū)分樣品的能力［11］。利用Loading 分析法對防風(fēng)藥材電子信號進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3，可知7 號傳感器（W1W） 和9 號傳感器（W2W） 對第一主成分的貢獻(xiàn)率最大，5 號傳感器（W5C） 對第二成分的貢獻(xiàn)率最大。結(jié)合表5 可知，7 號傳感器對于萜烯類靈敏度較高，9 號傳感器對于芳香類靈敏度較高，5 號傳感器對于烷烴類靈敏度較高，推測防風(fēng)揮發(fā)性成分可能是萜烯類芳香化合物及烷烴化合物。

圖3 Loading 分析結(jié)果

5.3 PCA 分析 主成分分析（PCA） 是將數(shù)據(jù)降維，分為第一、第二主成分貢獻(xiàn)率，通過比較兩者總貢獻(xiàn)率反映原始數(shù)據(jù)信息，以此判斷電子鼻技術(shù)對樣品的識別能力［12-13］。將3 種樣品傳感器響應(yīng)值進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見圖4，區(qū)分度見表6，可知第一、第二主成分貢獻(xiàn)率達(dá)99.318%。由表6 可知，抽薹防風(fēng)和其他2 種防風(fēng)的區(qū)分度較大，但栽培防風(fēng)和野生防風(fēng)有部分重合在一起，區(qū)分度不夠顯著。

圖4 3 種防風(fēng)PCA 分析圖

表6 3 種防風(fēng)區(qū)分度

5.4 LDA 分析 利用線性判別分析（LDA） 縮小組內(nèi)差距，擴(kuò)大組間差距［14］。組間差距越大，差異性越大，若第一、第二主成分之和的貢獻(xiàn)率相近，說明樣品之間氣味值的區(qū)分度較小。由圖5 可知，3 種防風(fēng)第一主成分貢獻(xiàn)率為27.96%，第二主成分貢獻(xiàn)率為16.59%，總區(qū)分率為44.55%，表明三者之間的區(qū)分度有部分重合，整體區(qū)分度不高。

圖5 LDA 分析結(jié)果

5.5 防風(fēng)氣味與主要成分含量相關(guān)性分析 采用SIMCA 14.0 軟件中的雙變量分析法，對電子鼻傳感器響應(yīng)值與防風(fēng)主要成分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖6 ～7。由此可知，色原酮（升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷） 含量僅與W2S 傳感器呈顯著正相關(guān)，與W5S、W2W 呈顯著負(fù)相關(guān)，說明W2S 傳感器響應(yīng)值越高，該類成分含量越高； 揮發(fā)油含量與W6S 和W3S 呈顯著正相關(guān)，與W5S 和W2W 呈顯著負(fù)相關(guān)，說明前兩者傳感器響應(yīng)值越高，該類成分含量越高。

圖7 揮發(fā)油與防風(fēng)氣味相關(guān)性分析圖

6 討論

由3 種防風(fēng)化學(xué)物質(zhì)含量測定結(jié)果可知，野生防風(fēng)揮發(fā)油含量最高，其次是栽培防風(fēng)，最次為抽薹防風(fēng)。防風(fēng)揮發(fā)油的組成主要為脂肪族和萜類化合物，具有較好的鎮(zhèn)痛、抗炎、止血等作用［15-16］。推測野生防風(fēng)的藥效優(yōu)于栽培防風(fēng)可能與其揮發(fā)油含量高有關(guān)。野生防風(fēng)的色原酮總量最高，抽薹防風(fēng)和栽培防風(fēng)含量相近，15 批樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量均符合2020 年版《中國藥典》 要求。防風(fēng)抽薹后色原酮總量并不減少，與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道一致。栽培防風(fēng)的多糖含量高于野生防風(fēng)及抽薹防風(fēng)，與栽培環(huán)境中水、肥等營養(yǎng)物質(zhì)充足有關(guān)［18］。防風(fēng)在抽薹后多糖含量下降，推測是因?yàn)橹参镞M(jìn)入生長繁殖期后，大量的多糖營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其他成分。

本實(shí)驗(yàn)借助電子鼻對不同防風(fēng)粉末的整體氣味進(jìn)行客觀化表達(dá)。對3 種防風(fēng)進(jìn)行氣味與化學(xué)成分之間相關(guān)性的分析得出，防風(fēng)中響應(yīng)值較高的是萜烯類芳香性化合物，該結(jié)果與文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道一致。根據(jù)電子鼻對氣味的響應(yīng)值來看，野生防風(fēng)＞抽薹防風(fēng)＞栽培防風(fēng)。而當(dāng)色原酮的含量較高時(shí)，其在電子鼻的響應(yīng)值也較高，可見氣味與化學(xué)成分的含量具有一定的相關(guān)性。結(jié)合SIMCA 軟件對防風(fēng)電子鼻氣味值與色原酮類、揮發(fā)油含量進(jìn)行相關(guān)性分析，可以得出W2S 傳感器、W3S 和W6S 傳感器與色原酮類、揮發(fā)油含量呈顯著正相關(guān)，傳感器響應(yīng)值越高，防風(fēng)中所對應(yīng)的成分含量越高。綜上所述，可根據(jù)電子鼻中W2S、W3S 和W6S 傳感器響應(yīng)值判斷防風(fēng)中色原酮類與揮發(fā)油的含量，但氣味濃郁程度是否會影響藥效發(fā)揮還需要進(jìn)一步研究。