山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌生物膜破壞及毒力酶釋放的影響

陳 靜，張佳寧，田紅茹，，趙志敏，，徐新軍，朱龍平，楊得坡，*

（1.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省現代中藥工程技術研究開發中心，廣東 廣州 510006）

目前，痤瘡、腦膜炎、敗血癥等細菌感染性疾病已越來越引起人們的重視，而細菌的致病性與誘導感染的能力與生物膜的形成及毒力因子的分泌密切相關［1-5］。痤瘡丙酸桿菌Cutibacteriumacnes作為一種條件致病菌，其在面部過度繁殖是痤瘡產生的主要原因之一，它還可以釋放一系列毒力因子或脂肪酶等毒力酶導致皮膚細胞產生炎癥反應，誘導痤瘡的發生［6-7］。同時，痤瘡丙酸桿菌產生生物膜幫助其留置于醫療器械上，增加置換手術術后感染的風險［8］。目前，很多天然產物具有良好的抑菌效果且不易產生多重耐藥性，可作為理想的抗菌劑使用［9］。

山蒼子是樟科木姜子屬植物山雞椒Litseacubeba（Lour.） Pers.的果實，是我國傳統木本精油植物資源，其揮發油具有濃郁的檸檬香味，是常見的的天然食用香料［10］。現代研究發現，山蒼子精油主要成分有檸檬醛、檸檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-側柏烯、檜烯、β-蒎烯、α-松油醇、β-月桂烯等，具有抑菌、抗炎、殺蟲等良好的藥理活性，在化妝品、食品、醫藥、化工及畜禽養殖等領域有著廣泛的應用潛力［10-11］。

本實驗對比了山蒼子精油主要成分對痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性，通過探究精油對菌生物膜的破壞及毒力酶分泌的影響及對痤瘡丙酸桿菌致病性的抑制作用，以期為其應用提供依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 山蒼子成熟果實于7 月中旬采自廣東省廣州市從化區，經中山大學藥學院楊得坡教授鑒定為正品，保存于中山大學藥學院生藥學與天然藥物化學實驗室。

檸檬醛、檜烯對照品（純度98%、98%，上海源葉生物科技有限公司）； 檸檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、β-蒎烯、α-松油醇、β-月桂烯對照品（純度95%、98%、98%、95%、98%、90%，上海麥克林生化科技有限公司）； α-側柏烯對照品（純度95%，信陽萊耀生物科技有限公司）。

Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司； 脂肪酶試劑盒Lipase assay kit 購自南京建成生物工程研究所； 結晶紫染色液購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 培養基 腦心浸出液肉湯（BHI） 干粉購自廣東環凱微生物科技有限公司； 強化梭菌瓊脂（RCA） 購自上海吉至生化科技有限公司。

1.3 菌株 痤瘡丙酸桿菌 （Cutibacteriumacnes，ATCC6919） 由中山大學藥劑學徐月紅課題組贈予，保存于中山大學藥學院生藥學與天然藥物化學實驗室。

1.4 儀器 紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）； Synergy H1 型酶標儀 （美國Bio-Tek 公司）；CytoFLEX S 型流式細胞分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）。

2 方法

2.1 山蒼子精油主要成分對細菌的MIC 測定 課題組前期研究表明，山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌有較好抑制作用［12］。根據美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI） 推薦，采用微量二倍稀釋法測定山蒼子精油主要成分對痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）［13］，將相應對照品連續對半稀釋后加入96 孔板中，1.0×105CFU/mL 大腸桿菌在質量濃度19.2～0.009 375 mg/mL 的精油中厭氧培養48 h 后測定MIC，設置陽性對照為氨芐西林，陰性對照為0.1% 吐溫80 溶液，每個濃度3 個平行，每組重復3 次。

2.2 山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌生物膜形成的影響

2.2.1 細菌表面疏水性測定 根據唐才林等［14］報道并作適當修改，將不同質量濃度精油組（200、400、800 μg/mL）、對照組（0.1%吐溫80 溶液） 菌液于37 ℃厭氧條件下培養6 d，培養結束后調整菌液OD600為0.5±0.05，加入2 mL 正十六烷至3 mL 菌懸液中，渦旋60 s混勻，室溫下靜置30 min，待有機相完全分離后吸去上層有機相，取水相測定值，并借助疏水性指數對細菌表面疏水性進行量化，公式如下。

2.2.2 細菌生物膜形成測定 參考先前研究方法，采用96 孔板結晶紫染色法。添加精油到一定濃度的菌液中，使其最終給藥質量濃度分別為200、400、800、1 600 μg/mL，在37 ℃厭氧條件下培養6 d，棄去上層浮游細胞，用無菌水洗滌后加入甲醇固定10 min，移去后風干5 min，用0.1%結晶紫對生物膜進行染色20 min，移除并加入95%乙醇脫色15 min，取脫色液100 μL 于空白96 孔板，用酶標儀在570 nm 波長處測定吸光度，以未添加精油對照組的生物膜形成為100%，對各實驗組生物膜形成百分比進行計算［15］。

2.2.3 細菌細胞內DNA、RNA 泄露實驗測定 參考陳嘉麗等［16］報道并稍加改動，給藥組為山蒼子精油（質量濃度為“2.2.2” 項下），對照組為0.1%吐溫80 溶液，2 組與細菌共培養1、2 h 后檢測培養基中DNA 和RNA。

2.2.4 Annexin V-FITC/PI 雙標記實驗 收集對數生長期的細菌，加入精油-吐溫溶液 （質量濃度為 “2.2.2” 項下），180 r/min 培養8 h 后離心，用PBS 緩沖液沖洗3 次，將菌懸液濃度稀釋為1.0×106CFU/mL，取100 μL，按照Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀進行檢測。

2.3 山蒼子精油對細菌釋放脂肪酶影響 痤瘡丙酸桿菌（1×109CFU/mL） 與質量濃度為400、200 μg/mL 的精油-吐溫80 溶液共培養，對照組與之前相同。在37 ℃、180 r/min厭氧條件下培養8 h 后離心取上清液，用脂肪酶試劑盒Lipase assay kit 檢測其脂肪酶的含量變化。

2.4 統計學分析 利用GraphPad Prism 8 軟件進行計算并作圖，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 山蒼子精油主要成分MIC 表1 顯示，各成分MIC 依次為α-松油醇、β-月桂烯＜4-萜烯醇、α-側柏烯與檜烯＜芳樟醇＜β-蒎烯＜檸檬醛。

3.2 細菌表面疏水性測定 對照組的初始疏水性指數為37.78%，精油干預后其隨給藥質量濃度增加而降低（P＜0.01），分別為20.99%、10.94%、7.35%，見圖1。

圖1 山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌表面疏水性的影響（n＝9）

3.3 生物膜形成測定 精油抑制痤瘡丙酸桿菌生物膜形成（P＜0.01），并且隨著給藥質量濃度增加分別減少至48.95%、75.97%、76.97%、80.73%，見圖2。

圖2 山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌生物膜形成的影響（n＝12）

3.4 DNA 和RNA 泄露實驗 精油干預1 h 后，上清液中DNA 含量隨給藥質量濃度增加而升高，分別是對照組的12.3、19.2、18.9、32.5 倍； 精油干預2 h 后，DNA 含量分別是對照組的18.4、25.4、25.9、34.1 倍，RNA 在培養基中的滲漏情況與DNA 基本一致，表明精油增加了細菌細胞膜的通透性（P＜0.01），并呈濃度和時間依賴性，見圖3。

圖3 山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌細胞膜通透性的影響（n＝9）

3.5 Annexin V-FITC/PI 雙標記法 利用FITC 標記的Annexin-V 與PI 進行雙染色，圖中4 個象限Q1～Q4 分別代表壞死細胞和碎片、死細胞、受傷細胞和活細胞。與對照組比較，精油干預后受傷細胞數量增加（P＜0.05），并且呈濃度依賴性； 為200 μg/mL 時，受傷細胞數量無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌Annexin V-FITC/PI 雙標記的影響（n＝3）

3.6 脂肪酶活性測定實驗 與對照組比較，添加了精油的培養基中脂肪酶隨著給藥質量濃度增加而減少（P＜0.01），分泌量分別減少78.6%、88.8%，見圖5。

圖5 山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌脂肪酶分泌的影響（n＝9）

4 討論

痤瘡是目前全球最常見的慢性皮膚病之一，據統計，全球有80%以上的人曾經或者現在正在受到該疾病的影響，其成因非常復雜，目前普遍認為是由過度角化、皮脂分泌、炎癥介質釋放及痤瘡丙酸桿菌皮脂腺定植導致的［17-18］。作為誘發痤瘡的重要菌株，痤瘡丙酸桿菌一直是研究熱點。與其他細菌一樣，由于存在缺乏新型抗生素、濫用抗生素等問題，天然產物被廣泛應用于痤瘡丙酸桿菌的治療［19］。

山蒼子揮發油是一種使用歷史悠久的芳香精油，很多研究表明，該精油對多種革蘭氏陽性、陰性菌均有很好的抑菌活性［10］。根據課題組前期對山蒼子精油藥敏活性篩選實驗發現，其對痤瘡丙酸桿菌有較好抑制作用。目前未見有關山蒼子精油各成分的抗痤瘡丙酸桿菌活性的研究報道，故本實驗評估了該精油各成分的抗菌效果，發現檸檬醛作為山蒼子精油主要成分（超過50%），其對痤瘡丙酸桿菌抑菌活性較好（MIC 為800 μg/mL）； 其他含量較低的成分，如α-松油醇、β-月桂烯、4-萜烯醇、α-側柏烯、檜烯、芳樟醇、β-蒎烯，均對該菌表現出較好的抑制作用。

痤瘡丙酸桿菌與金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌一樣，都屬于革蘭氏陽性菌。本實驗發現山蒼子精油會破壞痤瘡丙酸桿菌的細胞膜，造成細胞內重要生物大分子的外泄，這與之前報道的該精油對其他陽性菌細胞膜破壞現象類似［20-21］。根據Higaki 等［22］研究表明，痤瘡丙酸桿菌所釋放的脂肪酶是誘發痤瘡的重要致病因素。本實驗發現山蒼子精油對痤瘡丙酸桿菌脂肪酶釋放量有很好的抑制作用，精油在對細菌細胞無顯著性損傷的質量濃度（200 μg/mL） 下即可顯著抑制脂肪酶活性，說明精油可能通過抑制該毒力酶的分泌而降低誘發痤瘡的可能性。

綜上所述，山蒼子精油可能是通過破壞痤瘡丙酸桿菌生物膜及減少毒力酶的分泌，降低其誘導感染的能力。此外，該精油中的主要成分檸檬醛及其他含量較低的次要成分也有助于其抗痤瘡丙酸桿菌。