基于網絡藥理學和動物實驗探討芪遂逐水膏敷貼劑抗肝硬化腹水的作用機制

劉 茵，邱 華，毛德文，王明剛，余鈺娟，宋振恒，周曉云，黃永林

（1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病科，廣西 南寧 530023； 2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科，廣西 南寧 530000； 3.廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西 南寧 530001）

肝硬化是一種以彌漫性纖維化、肝內靜脈血流嚴重中斷、門脈高壓和肝衰竭為特征的進行性慢性肝病。當出現(xiàn)腹水、靜脈曲張出血時，會出現(xiàn)失代償性肝硬化［1］，其發(fā)病率高，能誘發(fā)許多自發(fā)性腹膜炎、肝腎綜合征等致命的并發(fā)癥［2］。目前，治療肝硬化腹水方法包括控制水和鈉鹽的攝入、利尿劑、腹腔穿刺放液配合靜脈輸注白蛋白、生長抑素及肝移植等，但遠期療效欠佳，且復發(fā)率高，需要巨額的醫(yī)療費用［3］。近年來，中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在肝病治療中協(xié)同作用好且副作用低［4］。芪遂逐水膏由黃芪、甘遂、木香、茯苓、丹參、益母草和大腹皮組成，具有益氣健脾、活血柔肝、溫陽暖腎、利水消腫等功效［5］，能有效促進肝硬化頑固性腹水患者腹水消退，改善肝功能［6］。本研究利用網絡藥理學分析芪遂逐水膏敷貼有效活性成分及其可能作用通路，構建復方中藥-單體化合物-藥物作用靶點-通路的作用網絡，并通過動物實驗驗證，為臨床更好地利用芪遂逐水膏敷貼提供理論基礎。

1 材料

1.1 藥物 芪遂逐水膏由黃芪、甘遂、木香、茯苓、益母草、丹參、大腹皮7 味中藥組成，由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房提供，經廣西中醫(yī)藥大學何報作教授鑒定為正品，按照前期確定的藥物提取方法、制劑基質配方、制劑工藝及質量標準制備芪遂逐水膏的凝膠膏劑型［7-9］。黃芪、茯苓、益母草加12 倍量水浸泡30 min，回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液； 取甘遂、木香、丹參、大腹皮加6 倍量85%乙醇浸泡30 min，加水回流提取2 次，每次1.5 h，合并提取液，過濾，將水煎液與乙醇回流提取液合并，濃縮得到浸膏，真空干燥，粉碎，制成干膏粉。在凝膠膏基質和透皮促滲劑中加入制備好的中藥干膏粉攪拌混勻，制備芪遂逐水凝膠膏，每片規(guī)格為6 cm×8 cm。本品每片含黃芪以黃芪甲苷計不低于0.693 2 mg，含甘遂以大戟二烯醇計不低于1.476 6 mg［8］。按成人與大鼠體表面積比例換算，統(tǒng)一裁制成1 cm×1 cm、2 cm×2 cm 2 種規(guī)格，在4 ℃下保存。

1.2 試劑與儀器 谷丙轉氨酶 （ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB） 試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司； 伊紅、中性樹脂、RIPA （強） 組織細胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（貨號E8090、G8590、R0010、PC0020）； 蘇木素購自武漢賽維爾生物科技有限公司（貨號G1004）； 血管內皮生長因子A （VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶8 （MAPK8）、蛋白激酶B1 （AKT1）、TP53、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG 購自武漢貝茵萊生物科技有限公司（貨號PAB30096、PAB33334、PAB30596、PAB34226、PAB36269、SAB43714）； PVDF 轉移膜、化學發(fā)光試劑購自美國Millipore 公司 （貨號IPVH00010、WBKLS0500）。mini protean 3 cell 電泳儀購自美國Bio-Rad公司； iCEN-24R 高速冷凍離心機購自杭州奧盛儀器有限公司； Tanon-5200 全自動化學發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 動物 SPF 級雄性SD 大鼠24 只，體質量200～250 g，來源于三峽大學（質量合格證號42010200005069），飼養(yǎng)于武漢華聯(lián)科生物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SYXK （鄂） 2018-0104。研究符合武漢華聯(lián)科生物技術有限公司倫理審查委員會有關動物研究指導原則（倫理審查號HLK-20210930-01）。

2 方法

2.1 芪遂逐水膏活性成分及靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http： //tcmspw.com/tcmsp.php，version 2.3） 進行數(shù)據(jù)挖掘，收集有效成分與作用靶點。通過對既往外敷型藥物有效成分的研究結果［10-11］，將化合物相對分子質量（MW） ≤500、辛醇與水分配系數(shù)（AlogP） ＜5、氫鍵供體數(shù) （Hdon） ＜5、氫鍵受體數(shù)（Hacc） ＜10、可旋轉鍵（RBN） ＜10 設置為篩選參數(shù)，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對應的靶點，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫將其名稱轉換為基因簡稱。

2.2 芪遂逐水膏預測靶點功能分析 通過構建蛋白質-蛋白質交互作用網絡（PPI），可清晰呈現(xiàn)靶點與靶點之間直接、間接的調控關系。使用STRING 數(shù)據(jù)庫分析靶點之間蛋白互作關系，DAVID 分析工具對獲得的靶蛋白進行基因本體（GO） 分析［12］，包括生物學過程（BP）、細胞定位（CC） 和分子功能（MF），各自描述了基因產物可能行使的分子功能、所處的細胞環(huán)境、參與的生物學過程，將P≤0.05 設定為顯著性基因富集的臨界值，使用R 軟件進行作圖。再采用京都基因與基因組百科全書（KEGG）［13-14］分析，物種設置為人（Homosapiens），以P＜0.05 為標準確定功能及重要通路，并對通路進行注釋和分析。

2.3 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點分析 采用GeneCards［15］（https： //www.genecards.org/） 數(shù)據(jù)庫中查找肝硬化腹水相關靶點，取活性成分預測靶點與疾病預測靶點交集，繪制韋恩圖。采用DAVID 分析工具對獲得的靶蛋白進行GO和KEGG 分析，以P＜0.05 為標準確定功能及重要通路，并對后者進行注釋和分析。

2.4 網絡藥理學網絡構建 選擇共有靶點中與肝硬化腹水相關的通路，使用Cytoscape 3.7.0 軟件繪制“靶基因-通路” 網絡圖。

2.5 動物實驗 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組、模型組與芪遂逐水膏敷貼高、低劑量組，每組6 只。除正常組外，其余各組大鼠第1 周給予35%苯巴比妥CMCNa 混懸液，然后背部皮下注射CCl4油溶液建立肝硬化腹水模型，14 周后芪遂逐水膏敷貼高、低劑量組分別給予2 cm×2 cm、1 cm×1 cm 規(guī)格敷貼于脫毛大鼠的腹部皮膚上，每天1 次，每次6 h，連續(xù)4 周。

常規(guī)乙醚麻醉大鼠后腹主動脈采血，離心，收集血清，全自動生化分析儀檢測ALT、AST 活性及TBIL、ALB 水平，收集肝組織，HE 染色觀察肝臟病理變化。

Western Blot 法檢測VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達，將大鼠肝臟剪碎，按比例加入裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清進行蛋白質濃度檢測，加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min 使蛋白變性，將配制好的PAGE 膠放入電泳槽中，上樣后電泳，濕轉轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜，加入一抗VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 （1 ∶1 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3 次，再加入二抗（1 ∶20 000） 室溫孵育1 h，TBST洗滌3 次，滴加ECL 化學發(fā)光液，以GAPDH 為內參，Image J 軟件計算相關條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 芪遂逐水膏活性成分及靶點篩選 共得到13 種活性成分和240 個預測靶點，見圖1。

圖1 “化合物-預測靶點個數(shù)” 花瓣圖

3.2 芪遂逐水膏靶蛋白PPI 分析 蛋白互作網絡圖見圖2，包含240 個節(jié)點、2 674條邊，平均節(jié)點度為22.3，PPI富集P＜1.0 × 10-16。使用Cytoscape 軟件中的network analyzer 工具對預測靶蛋白互作結果進行可視化分析，其中節(jié)點的大小和顏色的明暗與靶蛋白的節(jié)點度呈正比，節(jié)點越大，靶蛋白與其他蛋白的關聯(lián)度越大，結果見圖3。由此可知，AKT1、TP53、VEGFA、TNF、SRC、PTGS2、EGFR、CASP3、JUN、ESR1 等蛋白之間的相互作用具有重要地位，其中AKT1、TP53、VEGFA、TNF 鄰接靶標數(shù)目最多。

圖2 芪遂逐水膏活性成分預測靶點PPI 蛋白互作圖

圖3 芪遂逐水膏預測靶點蛋白互作可視化圖

3.3 芪遂逐水膏預測靶點功能分析 GO 分析顯示，芪遂逐水膏活性成分參與的生物學過程最多的為藥物反應、氧化應激、活性氧代謝過程等，主要涉及的細胞定位為膜筏、膜微域、囊腔等，分子功能主要有血紅素結合、四吡咯結合、氧化還原酶活性，作用于成對供體，結合或還原分子氧，見圖4。KEGG 分析顯示，芪遂逐水膏活性成分主要參與神經活性配體-受體相互作用、化學致癌作用-受體激活、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、脂質和動脈粥樣硬化等通路，見圖5。

圖4 芪遂逐水膏預測靶點的GO 功能分析柱狀圖

圖5 芪遂逐水膏預測靶點的KEGG 通路分析柱狀圖

3.4 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點分析 在GeneCard數(shù)據(jù)庫（https： //www.genecards.org/） 查找肝硬化腹水相關靶點作為預測靶點，共得到1 108 個。活性成分預測靶點與肝硬化腹水預測靶點取交集，繪制韋恩圖，見圖6，得到共有靶點86 個，PPI 蛋白互作圖見圖7，包含86 個節(jié)點、1 083 條邊，平均節(jié)點度為25.2，PPI 富集P＜1.0×10-16。其中，共有靶點中的核心基因為AKT1、VEGFA、TNF、TP53、CASP3、MMP9 等。

圖6 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點

圖7 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點PPI 蛋白互作圖

3.5 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點功能分析 GO 分析顯示，參與最多的生物學過程為藥物反應、氧含量反應等，主要涉及的細胞定位為膜筏、膜微域等，分子功能主要有DNA 轉錄因子結合、血紅素結合、四吡咯結合，見圖8。KEGG 分析顯示，其主要參與脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣化等通路，見圖9。

圖8 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點的GO 功能分析柱狀圖

圖9 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點的KEGG 通路分析柱狀圖

3.6 靶點-通路的網絡分析 基于共有靶點-通路關系使用Cytoscape 軟件構建靶點-通路網絡，可直觀地體現(xiàn)芪遂逐水膏通過多靶點和多通路治療肝硬化腹水的作用機制，見圖10。

圖10 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點-KEGG 通路網絡圖

3.7 肝臟病理學觀察 正常組肝臟結構清晰完整，肝細胞呈放射狀整齊排列，無炎癥細胞浸潤； 模型組肝臟結構明顯破壞，肝細胞排列紊亂，出現(xiàn)變性腫脹及壞死，伴有大量炎性細胞浸潤，纖維組織增生形成假小葉； 芪遂逐水膏低劑量組肝臟結構基本完整，輕微纖維組織增生，可見少量炎性細胞浸潤，較模型組有改善； 芪遂逐水膏高劑量組肝臟結構基本恢復正常，肝細胞索排列較整齊，可見散在的炎性細胞浸潤，見圖11。

圖11 各組大鼠肝組織染色（HE，×100）

3.8 芪遂逐水膏對ALT、AST 活性及TBIL、ALB 水平的影響 與正常組比較，模型組血清ALT、AST 活性及TBIL 水平升高，ALB 水平降低（P＜0.01），表明模型制備成功；與模型組比較，芪遂逐水膏低劑量組血清ALT、AST 活性降低（P＜0.05），TBIL、ALB 水平無明顯變化（P＞0.05），芪遂逐水膏高劑量組血清ALT、AST 活性及TBIL 水平降低（P＜0.01），ALB 水平升高（P＜0.01），見圖12。

圖12 芪遂逐水膏對ALT、AST 活性及TBIL、ALB 水平的影響（±s，n＝3）

3.9 芪遂逐水膏對VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53表達的影響 與正常組比較，模型組肝臟組織VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，芪遂逐水膏各劑量組肝臟組織VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖13。

圖13 芪遂逐水膏對VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 表達的影響（±s，n＝3）

4 討論

腹水是肝硬化最突出的臨床表現(xiàn)，肝硬化腹水的發(fā)生嚴重影響了肝硬化患者的生命質量與生存率，目前尚無特效療法［16］。中藥方劑具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在治療肝硬化腹水方面具有獨特的優(yōu)勢，但難以解釋其藥理作用機制。

TCMSP 發(fā)現(xiàn)，芪遂逐水膏組方13 種活性成分，其對應的靶點共有240 個，其中AKT1、TP53、VEGFA、TNF、SRC、PTGS2、EGFR、CASP3、JUN、ESR1 等蛋白具有重要地位。AKT 參與多種細胞功能，如生存、代謝、轉錄和翻譯等過程，在癌癥和炎癥性疾病中起調節(jié)作用［17-18］。VEGFA 是生理和病理狀態(tài)下最重要的血管內皮生長因子，參與腫瘤新生血管的形成，在腫瘤的形成、增殖和轉移中起著重要的作用［19］。caspase-3 是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成員之一，有證據(jù)表明它可促進癌細胞生長、細胞遷移和侵襲性，為疾病治療提供新靶點［20-21］。

PPI 蛋白互作圖分析發(fā)現(xiàn)，芪遂逐水膏和肝硬化腹水共有靶點中的核心基因為AKT1、VEGFA、TNF、TP53、CASP3、MMP9。GO 和KEGG 功能分析發(fā)現(xiàn)主要參與藥物反應和氧含量反應，具有DNA 轉錄因子結合、血紅素結合、四吡咯結合等分子功能，參與脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣化等通路，結果表明芪遂逐水膏對肝硬化腹水的治療是多靶點的。根據(jù)共有靶點-通路網絡圖分析發(fā)現(xiàn)，VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 與芪遂逐水膏治療肝硬化腹水密切相關。VEGFA 和CASP3 參與細胞凋亡和增殖等生物過程，與線粒體功能和凋亡密切相關，AKT1 磷酸化會降低氧化應激刺激的MAPK 激酶活性，從而防止細胞凋亡。MAPK 信號通路參與炎癥反應、細胞分化、細胞凋亡和腫瘤侵襲等多種生物學過程［22］。本研究構建肝硬化腹水動物模型后檢測血清肝功能指標，結果顯示模型組血清中ALT、AST 活性和TBIL 水平高于正常組，ALB 水平降低。肝臟病理組織檢查發(fā)現(xiàn)模型組肝臟結構破壞，纖維組織增生形成假小葉，有大量炎性細胞浸潤，表明模型制備成功。本研究進一步檢測肝臟中VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 的表達，結果顯示在肝硬化腹水模型中，VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達增加，給予芪遂逐水膏后蛋白表達降低。

綜上所述，芪遂逐水膏治療肝硬化腹水的可能機制是多成分、多靶點、多途徑的協(xié)同作用，可能與VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 有關，為臨床更好的利用芪遂逐水膏敷貼提供理論基礎。