基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實驗探討黃芪建中湯對脾胃虛寒型功能性消化不良的作用

曾格格，劉天琪，戴全武，黃振陽，何嘉偉，劉 毅

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D） 是臨床上最常見的胃腸道疾病之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，F(xiàn)D 全球發(fā)病率約10% ～30%，我國約18% ～25%，且多發(fā)于女性［1-2］。FD 具體發(fā)病機制尚未明確，可能與胃腸運動障礙、內(nèi)臟高敏感性、“腦-腸肽” 分泌異常、心理疾病或感染幽門螺桿菌等有關(guān)［3］。中醫(yī)將FD 歸屬于“痞滿” “胃脘痛” 范疇，病位在胃，與脾、肝相關(guān)，以脾虛氣滯，胃失和降為基本病機，關(guān)鍵發(fā)病機制是脾胃虛弱［4］。黃芪建中湯最早記載于《金匱要略》，是中醫(yī)臨床用于建中補虛、益氣固本的代表方［5］。其中，黃芪為君藥，健脾益氣； 桂枝、生姜為臣藥，溫陽散寒； 飴糖補脾緩急； 白芍緩急止痛； 大棗、甘草補益脾氣，共為佐使藥［6］。現(xiàn)黃芪建中湯已廣泛應(yīng)用于治療脾虛或以脾虛為主要證型的各類消化系統(tǒng)疾病［7-9］。目前對于黃芪建中湯治療FD 的研究多集中在療效觀察、臨床應(yīng)用，而對此方劑中各味中藥共同作用機制及網(wǎng)絡(luò)化協(xié)同作用尚不明確。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索黃芪建中湯干預(yù)脾胃虛寒型FD 的成分、靶點及信號通路，結(jié)合體內(nèi)實驗深入探究黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 的治療作用及作用機制，以期為黃芪建中湯臨床運用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級10 周齡昆明種雌性小鼠48 只，體質(zhì)量30～40 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （遼） 2020-0001］，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗動物房［實驗動物使用許可證號SYXK（鄂） 2017-0067］，室溫（25±3）℃，相對濕度40% ～55%，12 h/12 h 光照/黑暗交替，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實驗符合實驗動物福利與倫理委員會要求（倫理號HLK-20221115-001）。

1.2 藥物 參考《方劑學(xué)》［10］，黃芪建中湯由黃芪5 g（批號220402）、桂枝9 g （批號210621）、白芍18 g （批號220903）、甘草6 g （批號220203）、生姜9 g （批號211209）、大棗12 g （批號220522）、飴糖30 g （批號220910） 組成，飲片均購于湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典》 規(guī)定，每劑含89 g 生藥，常規(guī)煎煮濃縮至1 g/mL； 大黃（批號220614） 常規(guī)煎煮濃縮至1 g/mL。枸櫞酸莫沙必利分散片（亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號211112）。

1.3 試劑L-精氨酸（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號MB2140）； 碘乙酰胺（北京蘭杰柯科技有限公司，批號21167408）； 蔗糖（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20220505）。小鼠白細(xì)胞介素-6 （IL-6）、5-羥色胺（5-HT） ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號MU30044、MU30036）； 小鼠胃泌素（GAS） ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-ELM2669c）； 小鼠胃動素（MTL） 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，貨號MM-0211R2）； 蘇木素染液、伊紅染液（武漢谷歌生物科技有限公司）； GAPDH 抗體、蛋白激酶B（Akt） 抗體、磷酸化蛋白酶B （p-Akt） 抗體、山羊抗鼠和抗兔IgG 二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號60004-1-1g、10176-2-AP、28731-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K） 抗體、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K） 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號A22996、AP0854）。

1.4 儀器 分析天平（北京賽多利斯天平有限公司，型號ALC-210.2）； 全波長酶標(biāo)儀 （美國Thermo 公司，型號Multiskan FC）； 離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號TGL-16M）； 病理切片機（上海萊卡儀器有限公司，型號GT1001）； 正置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；恒溫箱（武漢奧普斯試驗設(shè)備有限公司，型號LGF-070A）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5）； 脫色搖床（北京六一儀器有限公司，型號WD-9405A）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 黃芪建中湯與FD 潛在靶基因篩選 通過TCMSP 平臺查詢黃芪、桂枝、白芍、生姜、甘草、大棗活性成分，以口服生物利用度（OB） ≥30%、類藥性（DL） ≥0.18為條件，篩選出藥物有效成分及相應(yīng)靶點［11］，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化； HERB 本草組鑒獲取飴糖活性成分及其作用靶點； 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫，以“functional dyspepsia” 為檢索詞，檢索FD 的治療靶點。將藥物成分靶點和疾病靶點取交集，得到黃芪建中湯治療FD 的潛在作用靶點。

2.1.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在作用靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用 （PPI） 網(wǎng)絡(luò)，運用Cytoscape 3.9.0 軟件中的Centiscape 插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯跃W(wǎng)絡(luò)中所有點 （Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality） 的中位數(shù)平均值為標(biāo)準(zhǔn)，3 個拓?fù)鋮?shù)值均大于中位數(shù)的靶點為核心靶點［12］。

2.1.3 GO、KEGG 通路富集分析 將潛在作用靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO、KEGG 通路富集分析，分別選取生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組成（cellular component，CC） 中P值排名前10 位的條目及P值排名前20 位的KEGG 信號通路，利用微生信網(wǎng)站 （http： //www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化分析。

2.1.4 “藥物-成分-靶點-通路-疾病” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以黃芪建中湯、有效成分、潛在作用靶點、主要通路和FD 作為“節(jié)點”，節(jié)點間的相互作用作為“邊”，構(gòu)建“黃芪建中湯-有效成分-潛在作用靶點-主要通路-FD” 網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Cytoscape 3.9.0 軟件進(jìn)行可視化。

2.1.5 分子對接 通過PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫尋找大分子結(jié)構(gòu)信息，PubChem 得到小分子3D 結(jié)構(gòu)，運用Auto Dock Tools及PyMOL 對裸蛋白進(jìn)行去水、加氫、檢查電荷等前處理，Open Babel GUI 軟件轉(zhuǎn)換格式，利用Auto Dock Vina 分子對接，采用PyMOL 進(jìn)行可視化處理。

2.2 動物實驗

2.2.1 模型建立 將48 只小鼠編號后稱定體質(zhì)量，隨機分為空白組、模型組、陽性組及高、中、低劑量組，每組8 只。依據(jù)文獻(xiàn)［13］ 報道采用綜合因素（碘乙酰胺＋饑飽失常＋游泳竭力＋L-精氨酸/冷大黃水煎液） 復(fù)制脾胃虛弱型FD 模型，持續(xù)8 d。

2.2.2 給藥及一般生存狀態(tài)觀察 造模結(jié)束后，根據(jù)人與動物體表面積系數(shù)換算［14］，高、中、低劑量組小鼠給藥劑量分別為15.38、7.67、3.84 g/kg 黃芪建中湯； 陽性組小鼠灌胃枸櫞酸莫沙必利分散片，給藥劑量為1.35 mg/kg；空白組與模型組每天灌胃給予等量體積生理鹽水，連續(xù)14 d。實驗過程中觀察各組小鼠一般生存狀況，并記錄體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量、毛發(fā)、游泳耐力等指標(biāo)。

2.2.3 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束后小鼠禁食24 h，稱定體質(zhì)量并處死，頜下靜脈取血，離心，取血清，剪取胃、十二指腸組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理實驗； 其余十二指腸組織裝入無菌離心管中，液氨中冷凍，放入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測。

2.2.4 胃排空率及小腸推進(jìn)率檢測 給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水24 h，稱定體質(zhì)量后灌胃給予黑色半固體糊狀物0.4 mL/只（3 g 羧甲基纖維素鈉溶于80 mL 蒸餾水中，依次加入奶粉5 g、蔗糖4 g、淀粉4 g、活性炭末2 g，攪拌均勻，即得），20 min 后處死，迅速開腹，將幽門至回腸部剪下，測量幽門至炭末前沿和幽門至回腸部的距離，計算小腸推進(jìn)率，公式為小腸推進(jìn)率＝ ［L（以幽門為起點至黑色糊狀物推進(jìn)距離） /S（小腸全長）］ ×100%。取出全胃，稱定質(zhì)量，沿胃大彎剪開，生理鹽水充分沖洗清潔后稱量胃凈重，計算胃排空率，公式為胃排空率＝ ［1- （胃總重-胃凈重） /所給糊重］ ×100%。

2.2.5 胃腸組織HE 染色病理學(xué)分析 取于4%多聚甲醛中固定24 h 以上的小鼠胃、十二指腸組織，修切、脫水、石蠟包埋、切片后蘇木素-伊紅染色，鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.2.6 ELISA 法檢測小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平 取各組小鼠血清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平。

2.2.7 Western blot 法檢測十二指腸組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá) 提取小鼠十二指腸組織總蛋白，二喹啉甲酸法（BCA） 法測定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌后孵育相應(yīng)一抗和二抗，暗室顯影，分析條帶灰度值，計算各目的蛋白相對表達(dá)。

2.2.8 免疫組化法檢測十二指腸組織EGFR 蛋白表達(dá) 小鼠十二指腸組織經(jīng)包埋、切片后，按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化EGFR 染色，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，表皮生長因子受體（EGFR） 表達(dá)的陽性結(jié)果為棕黃色。

2.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪建中湯與FD 潛在作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 篩選得到黃芪建中湯有效成分123 種，對應(yīng)2 165 個作用靶點，去重后得到308 個； FD 疾病靶點1 367 個。將藥物靶點與疾病靶點取交集后得到潛在作用靶點172 個。將其輸入STRING 數(shù)據(jù)庫生成PPI 網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 3.9.0 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯詈蟮玫?7 個核心靶點，見圖1，排名前15 位的關(guān)鍵核心靶點拓?fù)湫畔⒁姳?。

表1 關(guān)鍵作用靶點相關(guān)拓?fù)鋮?shù)

圖1 PPI 網(wǎng)絡(luò)中37 個核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 GO、KEGG 通路富集分析 GO 富集分析共416 條，其中BP 共187 條，主要富集在對基因表達(dá)的正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、對乙醇的反應(yīng)等； CC 共110 條，主要富集在細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、大分子復(fù)雜等； MF 共119 條，主要富集在酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性等，選取GO 分析各排名前十的功能條目進(jìn)行可視化。KEGG 通路富集分析共得到199 條相關(guān)通路（P＜0.01），主要富集在弓形體病、TNF 信號通路、癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路、IL-17 信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等信號通路，選取排名前20 條通路進(jìn)行可視化。見圖2。

圖2 黃芪建中湯治療FD 靶點GO （A）、KEGG （B） 富集分析圖

3.3 黃芪建中湯治療FD 的“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò) 圖3 顯示，網(wǎng)絡(luò)中共涉及459 個節(jié)點和3 145 條邊，平均度值為13.70，平均相鄰節(jié)點數(shù)目為6.852，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.446，最短路徑為3.036，說明黃芪建中湯治療FD的過程是多成分、多靶點起效的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，與中藥作用的整體性、系統(tǒng)性和綜合性相吻合。

圖3 黃芪建中湯治療FD “藥物-成分-靶點-通路-疾病” 網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 分子對接 選擇排名靠前的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和柚皮素，與交互網(wǎng)絡(luò)中度值較高的關(guān)鍵核心靶點EGFR、Akt1、CASP3 和VEGFA 進(jìn)行分子對接，結(jié)合能越小，分子之間親和力越好，＜-7 kcal/mol 表示親和活性良好，＜-9 kcal/mol 表示親和活性非常強［15］； 對接得分越低，配體與靶點之間結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)果見表2。再根據(jù)對接評分篩選最佳結(jié)合模式，進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖4。

表2 核心成分與關(guān)鍵靶點結(jié)合能

圖4 分子對接結(jié)果可視化分析圖

3.5 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率的影響 與空白組比較，模型組小鼠小腸推進(jìn)率、胃排空率降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠小腸推進(jìn)率、胃排空率升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。

圖5 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率的影響（±s，n＝8）

3.6 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清GAS、IL-6 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），MTL、5-HT 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組和高、中劑量組小鼠血清GAS、IL-6 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），MTL、5-HT 水平升高（P＜0.05，P＜0.05），而低劑量組小鼠血清GAS、IL-6 水平降低（P＜0.05），MTL 水平升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠血清GAS、MTL、IL-6、5-HT 水平的影響（±s，n＝8）

3.7 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃、十二指腸組織病理形態(tài)的影響 各組小鼠胃組織結(jié)構(gòu)清晰，胃黏膜整齊完整，未見明顯炎細(xì)胞、水腫、充血等病理改變。空白組小鼠十二指腸黏膜整齊完整，未見明顯炎性浸潤； 模型組小鼠十二指腸絨毛排列散亂，黏膜層出現(xiàn)腫脹、炎性浸潤現(xiàn)象； 與模型組比較，各給藥組十二指腸絨毛排列整齊程度有所改善，黏膜層炎性細(xì)胞浸潤出現(xiàn)不同程度改善，見圖7。

圖7 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠胃、十二指腸組織病理形態(tài)的影響（HE 染色，×100）

3.8 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠十二指腸組織PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，陽性組和高、中劑量組小鼠十二指腸組織p-Akt、p-PI3K 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖8。

圖8 黃芪建中湯對各組小鼠十二指腸組織PI3K/Akt 通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

3.9 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠十二指腸組織EGFR 蛋白表達(dá)的影響 空白組幾乎不見EGFR 的陽性表達(dá)； 與模型組比較，各給藥組EGFR 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖9。

圖9 黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠十二指腸組織EGFR 蛋白表達(dá)的影響（×200，±s，n＝3）

4 討論

FD 是一種典型的身心共病的慢性疾病，因其病理的復(fù)雜性及與精神情緒的密切相關(guān)性嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、身心健康。西藥可在短時間內(nèi)改善患者的臨床癥狀，但由于副作用不宜長時間服用，且停藥后較易復(fù)發(fā)。中醫(yī)藥治療FD 可以從改善消化道癥狀和精神癥狀兩方面同時發(fā)揮作用，不良反應(yīng)小，更適合長期治療，逐漸成為首選的治療方法。

黃芪建中湯作為健脾類經(jīng)典方，建中氣、補脾胃、平調(diào)陰陽，使氣血生化有源，陰陽升降之樞調(diào)和，主要集中于治療消化系統(tǒng)疾病［16］。當(dāng)機體長期處于精神刺激下可導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)功能失常，出現(xiàn)惡心、嘔吐、納差、腹脹、腹痛等癥狀，稱為腦腸軸分泌異常［17］，被視為FD發(fā)病的重要核心機制之一。GAS、MTL、5-HT 是重要的腦腸肽物質(zhì)，對胃腸功能具有調(diào)節(jié)作用，此外，5-HT 也是參與心理、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)的重要神經(jīng)遞質(zhì)［18］。IL-6 調(diào)控炎癥的多種信號通路，作為重要的炎癥因子，IL-6 在胃黏膜中水平變化也側(cè)面反映了機體的炎癥及受損程度［19］。本研究結(jié)果表明，給藥組小鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率增加，小鼠血清GAS、IL-6 水平降低，MTL、5-HT 水平升高，各組小鼠胃組織病理切片均未見明顯病理現(xiàn)象，與FD 患者臨床癥狀相一致； 但十二指腸組織病理形態(tài)出現(xiàn)不同程度炎癥浸潤現(xiàn)象，與模型組比較，各給藥組均出現(xiàn)不同程度改善，說明黃芪建中湯對脾胃虛寒型FD 小鼠腦腸-軸功能紊亂具有改善作用，可促進(jìn)胃動力，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)小鼠胃腸黏膜。

分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，度值排名靠前的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素與核心靶點Akt1、VEGFA、CASP3、EGFR 分子生物結(jié)合親和力高，具有較好的藥效活性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到37 個核心靶點，KEGG 主要富集在PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等。PI3K-Akt 信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增生、遷移、分化和代謝。（EGFR是重要的胃黏膜防御因子，是PI3K/Akt 信號通路幾個關(guān)鍵上游調(diào)控蛋白之一［20］。EGFR 通過激活A(yù)kt、PI3K 等下游靶點來調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種重要的生物學(xué)過程，抑制胃酸和胃蛋白分泌，改善胃黏膜血流，降低IL-6水平，保護(hù)胃黏膜免受損傷，在胃黏膜的修復(fù)過程中起著重要的作用［21］。本研究結(jié)果顯示，各給藥組十二指腸PI3K-Akt 信號通路被激活、EGFR 蛋白表達(dá)上調(diào)，提示可針對FD 癥狀，黃芪建中湯通過上調(diào)EGFR 進(jìn)而激活作用于PI3K/Akt 生存通路，使胃防御因子啟動自我修復(fù)機制，增強了胃黏膜的修復(fù)水平，發(fā)揮治療的作用。

近年來中醫(yī)藥發(fā)展較快，許多中醫(yī)藥開始廣泛應(yīng)用于FD 的治療中，有效提高了該疾病的治療效果。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測了黃芪建中湯治療脾胃虛寒型FD 的關(guān)鍵成分、核心靶點及主要通路，并通過動物模型進(jìn)行驗證，以期為黃芪建中湯臨床進(jìn)一步應(yīng)用于治療FD 提供理論依據(jù)。