洋川芎內酯I 通過調控Nrf2 表達對脂多糖誘導的星形膠質細胞活化及功能的影響

曹好好，劉 濤，許美霞

（武漢市第四醫院重癥醫學科，湖北 武漢 430033）

膿毒癥所致腦功能障礙 （sepsis-induced brain dysfunction，SIBD） 是一種彌漫性腦功能障礙，由非中樞神經系統感染的膿毒癥所致，因此也被稱為膿毒癥相關性腦病（sepsis-associated encephalopathy，SAE），是膿毒癥患者嚴重的中樞神經系統并發癥［1］。近年來，臨床上發現合并SAE 的患者預后明顯變差［2］，是決定膿毒癥死亡率的關鍵因素之一［3-4］。然而，對于SAE 的治療，臨床上尚沒有特異性的診斷和治療手段。血腦屏障（BBB） 完整性破壞是SAE 發展的關鍵因素［5］。星形膠質細胞是BBB 的重要組成部分，在維持中樞神經系統的穩態和功能中扮演著十分重要的角色［6］。Nrf2 被認為是細胞對抗氧化損傷最重要的作用機制之一［7］。多項研究證實，川芎的多種有效成分能透過BBB，有效減輕炎癥因子和氧化應激對腦組織的損傷［8-10］。但目前該藥物成分洋川芎內酯I 針對星形膠質細胞功能調節作用及其分子機制的研究尚未見報道。因此，本研究通過LPS 刺激星形膠質細胞并檢測相關指標，探討洋川芎內酯I 對星形膠質細胞功能的影響及機制，以期為川芎在膿毒癥腦病治療方面提供理論參考。

1 材料

1.1 細胞 大鼠神經星形膠質細胞（貨號CP-R137） 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用含10%胎牛血清及雙抗的培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養，按時更換新培養液。

1.2 試劑與藥物 洋川芎內酯I （上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號S412878）。Nrf2 特異抑制劑ML385 （美國MCE 公司，貨號846657-71-9）。胎牛血清（美國Gibco公司，貨號10270-106）； 大鼠星形膠質細胞完全培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CM-R137）； 脂多糖（美國Sigma 公司，貨號L3012）； 一氧化氮檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號S0021S）； 兔抗GFAP 多克隆抗體、Nrf2 多克隆抗體、HRP 標記羊抗兔IgG（武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號 PAB36507、PAB30175、SAB43732）； 兔抗iNOS 多克隆抗體 （英國Abcam 公司，貨號ab283655）； CCK-8 試劑（北京索萊寶科技有限公司，貨號CA1210）； MDA 檢測試劑盒、SOD 活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號A003-1-2、A001-3-2）。

2 方法

2.1 分組 星形膠質細胞以1.0×105/mL 的密度接種于96孔板中，培養24 h 后分為①對照組，培養基培養，不作任何處理； ②LPS 組，1 μg/mL LPS 干預24 h； ③LPS＋不同濃度洋川芎內酯I 組，分別以20、50、100 μmol/L 洋川芎內酯I 與1 μg/mL LPS 共同干預24 h； ④LPS＋ML385 組，先用終濃度為10 μmol/L 的ML385 預處理24 h，再予以1 μg/mL LPS 共同干預24 h； ⑤LPS＋洋川芎內酯I＋ML385組，用終濃度為10 μmol/L 的ML385 預處理24 h，再予以50 μmol/L 洋川芎內酯I 和1 μg/mL LPS 共同干預24 h。

2.2 CCK-8 法檢測星形膠質細胞活性 將星形膠質細胞混懸液按每孔3.0×103個細胞的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，按“2.1” 項下方法處理細胞，培養24 h。取出細胞培養板，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續培養4 h，使用酶聯免疫檢測儀在450 nm 波長處測量各孔光密度（OD） 值。

2.3 Western blot 法檢測星形膠質細胞GFAP、Nrf2、iNOS蛋白表達 從星形膠質細胞裂解液中分離出總蛋白，BCA試劑盒測定濃度，進行SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，5%BSA 封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3次，加入二抗室溫孵育1 h，ECL 顯影。以GAPDH 為內參，通過Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

2.4 Griess 法檢測細胞培養上清液NO 水平 細胞按“2.1” 項下方法處理，培養24 h 后收集上清液，按試劑盒說明書檢測NO 水平。

2.5 比色法檢測細胞SOD 活性和MDA 水平 細胞按“2.1” 項下方法處理，培養24 h 后與0.1 mol/L TBA、0.05 mmol/L EDTA 溶液混合，加入1% TritonX100 50 μL，置于振蕩器上反應1 min，再加入100 μL HPO3溶液，將蛋白沉淀于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，嚴格按照相應試劑盒說明書操作，檢測SOD 活性及MDA 水平。

2.6 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 洋川芎內脂I 對星形膠質細胞活性的影響 如圖1 所示，與對照組比較，LPS 組細胞活性增加（P＜0.01）； 與LPS 組比較，LPS ＋ML385 組細胞活性增加 （P＜0.01），LPS＋洋川芎內酯I 不同濃度組細胞活性降低（P＜0.01）；與LPS＋洋川芎內酯I 50 μmol/L 組比較，LPS＋洋川芎內酯I＋ML385 組細胞活性升高（P＜0.01）。

圖1 洋川芎內脂I 對星形膠質細胞活性的影響（±s，n＝6）

3.2 洋川芎內酯I 對星形膠質細胞SOD 活性和MDA、NO水平的影響 如表1 所示，與對照組比較，LPS 組細胞SOD 活性降低 （P＜0.01），MDA、NO 水平升高 （P＜0.01）； 與LPS 組比較，LPS＋ML385 組細胞SOD 活性降低（P＜0.01），MDA、NO 水平升高（P＜0.01），LPS＋洋川芎內酯I 不同濃度組細胞SOD 活性升高（P＜0.01），MDA、NO 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與LPS＋洋川芎內酯I 50 μmol/L 組比較，LPS＋洋川芎內酯I＋ML385 組細胞SOD活性降低（P＜0.01），MDA、NO 水平升高（P＜0.01）。

表1 洋川芎內酯I 對星形膠質細胞SOD 活性和MDA、NO 水平的影響（±s，n＝5）

表1 洋川芎內酯I 對星形膠質細胞SOD 活性和MDA、NO 水平的影響（±s，n＝5）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與LPS 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01； 與LPS＋洋川芎內酯I 50 μmol/L 組比較，△△P＜0.01。

組別SOD/（U·mg prot-1）MDA/（nmol·mg prot-1）NO/（μmol·L-1）對照組63.90±0.133.73±0.1511.12±0.18 LPS 組47.02±0.83**9.01±0.30**20.37±0.34**LPS＋洋川芎內酯I 20 μmol/L 組51.35±1.11＃＃8.52±0.32＃18.71±0.46＃＃LPS＋洋川芎內酯I 50 μmol/L 組58.05±1.18＃＃7.08±0.27＃＃15.11±0.31＃＃LPS＋洋川芎內酯I 100 μmol/L 組62.25±0.69＃＃6.21±0.24＃＃11.65±0.32＃＃LPS＋ML385 組45.71±0.92＃9.40±0.29＃21.64±0.36＃＃LPS＋洋川芎內酯I 50 μmol/L＋ML385 組50.59±0.92＃＃△△8.83±0.45△△19.63±0.44＃＃△△

由此可知，洋川芎內酯I 在20 ～100 μmol/L 濃度范圍內對LPS 誘導的星形膠質細胞均有較好的保護作用，故選擇50 μmol/L 進行后續機制探索。

3.3 洋川芎內脂I 對星形膠質細胞GFAP 熒光表達的影響 如圖2 所示，與對照組比較，LPS 組細胞GFAP 熒光強度增強； 與LPS 組比較，LPS＋ML385 組細胞GFAP 熒光強度增強，LPS＋洋川芎內酯I 組細胞GFAP 熒光強度減弱；與LPS＋洋川芎內酯I 組比較，LPS＋洋川芎內酯I＋ML385 組GFAP 熒光強度增強。

圖2 各組星形膠質細胞GFAP 免疫熒光反應

3.4 洋川芎內酯I 對星形膠質細胞GFAP、Nrf2、iNOS 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與對照組比較，LPS 組細胞GFAP、iNOS 蛋白表達升高（P＜0.01），Nrf2 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與LPS 組比較，LPS ＋ML385 組細胞GFAP、iNOS 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），Nrf2 蛋白表達降低（P＜0.05），LPS＋洋川芎內酯I 組細胞GFAP、iNOS 蛋白表達降低（P＜0.01），Nrf2 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與LPS＋洋川芎內酯I 組比較，LPS＋洋川芎內酯I＋ML385 組GFAP、iNOS 蛋白表達升高（P＜0.01），Nrf2 蛋白表達降低（P＜0.01）。

圖3 洋川芎內酯I 對星形膠質細胞GFAP、Nrf2、iNOS 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

4 討論

目前認為，血腦屏障破壞和氧化應激是SAE 重要的病理生理基礎，各種損傷因素如感染、炎癥、顱腦損傷、卒中、神經退行性疾病等，均會導致星形膠質細胞活化。一方面，活化的星形膠質細胞通過延長足突、遷移，對BBB起到直接的物理支持作用，還能分泌如血管生成素-1（ANG-1）、膠質源性神經營養因子（GDNF） 的一些保護性細胞因子［11］。膿毒癥時，炎性因子、活性氧族（ROS） 和活性氮族（RNS） 持續大量產生，直接造成星形膠質細胞損傷，導致血腦屏障物理結構被破壞。另一方面，過度活化的星形膠質細胞不僅會持續、大量分泌炎癥因子，而且在氧化應激反應過程中產生的各種自由基通過激活多種炎癥信號通路，又進一步刺激星形膠質細胞釋放炎癥因子。此外，過度活化的星形膠質細胞還能分泌包括血管內皮生長因子、NO 和內皮素等活性因子，通過不同方式造成BBB破壞［12-13］。

氧化應激是破壞血腦屏障的重要因素。有研究表明，膿毒癥患者的長期認知功能障礙與膿毒癥早期即出現的氧化應激有關［14］。Nrf2 在對抗氧化損傷的過程中扮演著關鍵角色。馮竟成、徐革等［15-16］研究表明，上調Nrf2 介導的抗氧化通路對大鼠血腦屏障具有保護作用。另有研究顯示，上調Nrf2/HO-1 表達可使星形膠質細胞發生具有保護作用的反應性增生［17］。本實驗結果顯示，LPS 誘導星形膠質細胞的活性增加，細胞活化的主要標志蛋白GFAP 表達升高，同時細胞內iNOS 表達上調，SOD 活性降低，MDA 和NO 水平升高。川芎有效成分在治療膿毒癥方面的研究也有較多報道［18-19］。洋川芎內酯I 是一種從川芎中提取出的單體。本實驗結果顯示，以不同濃度的洋川芎內酯I 干預后，星形膠質細胞活性降低，GFPA、iNOS 表達下調，Nrf2 表達上調，SOD 活性升高，MDA 和NO 水平降低； 在同時加入Nrf2 特異性阻滯劑ML385 后，洋川芎內酯I 的保護作用被減弱，提示洋川芎內酯I 可能是通過上調Nrf2 表達起到對LPS 誘導的星形膠質細胞的保護作用，因ML385 并不能完全抑制洋川芎內酯I 這種保護作用，提示洋川芎內酯I 可能還通過其他通路同時發揮保護作用。

綜上所述，洋川芎內酯I 可減輕LPS 誘導的星形膠質細胞的過度活化，減輕氧化應激產物的釋放，增加抗氧化產物的表達，其機制可能與上調Nrf2 表達有關，但仍需大量實驗研究加以確定。