桑葚中性多糖結構及其對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用

劉富饒，郭子萌，任 婷，李 波，吳 巍，李 慧，焦麗麗*

（1.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117； 2.長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117）

氧化應激是機體受到不良刺激時，產生的過量自由基超出細胞抗氧化防御能力，造成機體氧化與抗氧化作用失衡的現象。持續的氧化應激可導致脂質過氧化、蛋白質和DNA 損傷，引發衰老和肝損傷［1］。D-半乳糖誘導可加速活性氧（ROS） 的產生并使細胞產生氧化損傷，從而導致機體衰老［2］，為研究衰老的經典模型。

張培麗等［3］發現，桑葚多糖對H2O2誘導的PC-12 細胞氧化損傷具有保護作用。桑葚多糖可以改善細胞脂質積累、內源性抗氧化性防御能力從而起到抗氧化減緩衰老的作用［4］。已有研究證明了桑葚多糖的抗氧化活性，但其抗衰老的構效關系并未闡明。桑葚中性多糖的分離及其對D-半乳糖誘導小鼠衰老模型的抗氧化作用的研究也未見報道。基于此，本研究進一步分離出桑葚中性多糖，初步檢測其一級結構，通過建立D-半乳糖致小鼠衰老模型，探討桑葚多糖對小鼠肝組織及血清抗氧化指標的影響，以期為進一步開發具有抗氧化能力的桑葚多糖產品和桑葚多糖構效關系提供依據。

1 材料

1.1 儀器 DZKW 型電熱恒溫水浴鍋（天津天泰儀器有限公司）； Infinite M200 PRO 型酶標儀（瑞士Tecan 公司）；Ultimate 3000 型液相色譜系統、Nicolet5700 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司）； Inertsil ODS-3 型色譜柱（北京迪科馬科技有限公司）； Centrifuge 5810R 型離心機（德國Eppendorf 公司）； SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 動物 SPF 級昆明小鼠，體質量（20±2） g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK （遼） 2020-0001，飼養于長春中醫藥大學實驗室，溫度（21±2）℃，相對濕度（50±5）%。

1.3 試劑與藥物 桑葚購自吉林省中藥材商店，經長春中醫藥大學藥學院王淑敏教授鑒定為正品。D（＋） -無水葡萄糖 （ 批號 Y19F11J108781）、L-阿拉伯糖 （ 批號Z27O11H128825）、D-半乳糖（批號Z22J9H64187） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號20210518）、超氧化物歧化酶（SOD，批號20210518）、丙二醛（MDA，批號20210517）、過氧化氫酶可見光試劑盒（CAT，批號20210517） 均購自南京建成生物工程研究所； BCA 蛋白定量試劑盒（批號20210713） 購自北京索萊寶科技有限公司。無水乙醇為分析純。

2 方法

2.1 提取與純化 參考文獻［5］ 報道，取干燥后的桑葚500 g，加入5 L 蒸餾水，沸水提取3 次，提取時間分別為3、2、2 h，合并提取液，120 目篩過濾，80 ℃水浴濃縮，加入無水乙醇使乙醇終體積分數為80%，室溫靜置24 h，收集沉淀，蒸餾水復溶后冷凍干燥，得到粗多糖。采用Sevag 法進行脫蛋白，并采用截留分子量3 500 Da 的透析袋進行透析，濃縮透析內液，凍干得到桑葚多糖。

參考文獻［6］ 報道，將桑葚多糖溶解于蒸餾水中，5 000 r/min 離心5 min，取上清液經DEAE 纖維素進一步分離，用蒸餾水洗脫，苯酚硫酸跟蹤檢測，Sepharose CL-6B色譜柱（2.6 cm×100 cm） 進一步純化，用生理鹽水洗脫，體積流量0.5 mL/min，每管20 min，苯酚硫酸跟蹤檢測，收集多糖級分，糖液透析濃縮后冷凍干燥，得到桑葚中性多糖。

2.2 理化性質測定 以D-葡萄糖繪制標準曲線，采用苯酚-硫酸法測定純度，采用考馬斯亮藍法測定桑葚中性多糖中蛋白質含量。

2.3 分子量測定 采用高效液相色譜法測定桑葚中性多糖的分子量分布［7］。UltiMate 3000 系統，配備示差折光檢測器和TSK-G3000 PWXL 色譜柱（7.8 mm×30.0 cm）； 流動相超純水； 體積流量0.5 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量20 μL。以分子量5 250、9 750、13 050、36 800、64 650、135 350、300 600 Da 葡聚糖對照品的保留時間和相對分子質量對數繪制標準曲線，求得分子量。

2.4 單糖組成測定 將多糖樣品（5 mg/mL，100 μL） 用三氟乙酸（2 mol/L，400 μL） 在水解瓶中120 ℃水解4 h，反復加入甲醇去除過量的三氟乙酸，真空干燥，經苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 衍生化后過0.22 μm 微孔水系濾膜。參考文獻［8］ 報道，色譜條件為Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流動相PBS （pH 7.0） -乙腈（82 ∶18）； 體積流量1.0 mL/min； 檢測波長245 nm；進樣量20 μL。

2.5 傅里葉變換紅外光譜測定 將干燥后的桑葚中性多糖與溴化鉀粉末按照1 ∶200 比例均勻研磨，取適量壓成透明均勻薄片，收集4 000～500 cm-1范圍內紅外光譜。

2.6 分組與給藥 參考文獻［9］ 報道，60 只小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為空白組、模型組、陽性組、桑葚中性多糖給藥組（10、100、200 mg/kg），空白組小鼠灌胃給予生理鹽水（0.1 mL/10 g），陽性組小鼠腹腔注射維生素C，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射D-半乳糖（1.35 g/kg） 進行造模，同時給藥，連續7 周。

2.7 血清與組織樣品制備 末次給藥后，小鼠禁食12 h，摘眼球取血后脫頸椎處死，取肝臟、脾臟、腦組織。

2.7.1 血清 小鼠眼球取血后靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，吸取上清，-80 ℃保存，即得。

2.7.2 10%肝組織勻漿 小鼠肝組織-生理鹽水（1 ∶9）在冰浴條件下混合勻漿，勻漿液3 500 r/min 離心15 min，吸取上清，-80 ℃保存，即得。

2.8 SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px 活性及MDA 水平檢測 嚴格按照相關試劑盒說明書操作，分別檢測各組小鼠血清和肝組織SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px 活性及MDA 水平，考察不同劑量桑葚中性多糖在血清和肝組織中對抗氧化作用相關指標的影響。

2.9 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，各組間樣品均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 理化性質分析 經水提、醇沉獲得桑葚粗多糖，收率為7.23%，經超濾及色譜法進一步分離后獲得中性多糖，其收率為19.15%，苯酚硫酸法檢測其純度為76.18%，考馬斯亮藍法檢測其含痕量的蛋白（含量＜1%）。

3.2 分子量測定 以葡聚糖對照品保留時間為橫坐標（X），分子量對數為縱坐標（Y） 繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝-0.355X＋9.811 （r＝0.995 0）。依據相對保留時間，計算得到中性多糖分子量為1.068×104Da。

3.3 單糖組成測定 經完全酸水解及PMP 衍生檢測中性多糖的單糖組成，見圖1，可知主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，摩爾比為12.83 ∶1 ∶2.85。另外，中性多糖是以葡萄糖為主的中性雜多糖，其中葡萄糖含量高達76.9%。

圖1 桑葚中性多糖的單糖組成PMP-HPLC 色譜圖

3.4 紅外光譜分析（FT-IR） 由圖2 可知，3 404.69 cm-1處較寬吸收峰為中性多糖中-OH 伸縮振動吸收峰；2 922.70 cm-1處為甲基或次甲基的C-H 伸縮振動吸收峰；1 632.35 cm-1處為羥基彎曲振動吸收峰； 在1 740 cm-1附近沒有特征吸收峰，說明中性多糖不含糖醛酸［10］； 1 200 ～1 000 cm-1內存在的吸收峰為多糖指紋圖譜，證明其為吡喃糖； 804.03、851.23 cm-1處吸收峰則表明中性多糖中同時含有α-糖苷鍵和β-糖苷鍵［11］。

圖2 桑葚中性多糖紅外光譜圖

3.5 桑葚中性多糖對D-半乳糖誘導衰老小鼠氧化應激的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清和肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組與100、200 mg/kg桑葚中性多糖組小鼠血清及肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖3 ～4。與模型組比較，200 mg/kg 桑葚中性多糖組小鼠血清中SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 酶活性分別升高49.2%、45.1%、94.5%、63.2%； 肝組織中SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 酶活性分別升高76.1%、54.9%、66.7%、25.8%，MDA 水平降低28.6%，而50 mg/kg 桑葚中性多糖組作用不明顯。由此可知，桑葚中性多糖能修復D-半乳糖誘導的抗氧化酶活性降低，并抑制MDA 的產生，進而修復氧化損傷。

圖3 桑葚中性多糖對衰老小鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s，n＝10）

圖4 桑葚中性多糖對衰老小鼠肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT 活性及MDA 水平的影響（±s，n＝10）

4 討論

氧化損傷是指產生的過量自由基和活性氧堆積，超出細胞抗氧化防御能力，造成機體氧化與抗氧化作用失衡的現象，氧化損傷可導致細胞死亡，誘發DNA 損傷、炎癥、糖尿病、動脈粥樣硬化和神經退行性疾等。抗氧化劑可以清除活性氧并抑制氧化損傷誘導的細胞死亡［12］。人工合成的酚類抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ） 在油脂儲存中被廣泛應用，但其對人體存在一定的副作用［13］。與之相比，天然的抗氧化劑具有無毒、副作用的優勢，越來越受到重視。抗氧化作用是多糖重要活性之一，多種植物多糖被證實具有抗氧化作用。

多糖是一類結構復雜的生物大分子，其結構特征如單糖組成、分子量分布、以及糖基排列順序等均能影響其生物活性。Huang 等［14］研究發現，多糖的抗氧化活性與其單糖的組成和比例關系密切。以往的研究發現酸性多糖具有良好抗氧化活性，其中糖醛酸或蛋白質含量較高的多糖容易貢獻氫原子，從而發揮較好的抗氧化活性［15］。張佳琦［16］使用熱水提取桑葚多糖，并分利用不同濃度乙醇醇沉獲得酸性多糖MFPs-30-80，具有良好的抗氧化活性。但是，Ahmadi 等［17］和Li 等［18］研究也表明，多糖中的阿拉伯糖和半乳糖是抗氧化活性最重要的單位，含有阿拉伯半乳糖聚糖結構域的多糖的抗氧化活力較為顯著［19］。而本研究利用沸水提取，80%乙醇醇沉和離子交換柱層析法從桑葚中獲得中性雜多糖，其主要由葡萄糖構成，但同時含有約23%阿拉伯糖和半乳糖。利用D-半乳糖誘導的氧化損傷模型研究發現，桑葚中性多糖能夠明顯修復由D-半乳糖誘導的氧化損傷。