液質聯用技術鑒定至寶三鞭丸化學成分

高文雅，趙海譽，高雙榮，趙小亮，焦 玥，劉 洋，王志國，高 暢，李 濤，*，杜茂波*

（1.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700； 2.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700）

至寶三鞭丸由海狗鞭、狗鞭、鹿鞭、人參、鹿茸、海馬、蛤蚧、肉蓯蓉等四十多味名貴中藥材組成，收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》，具有補血生精、健腦補腎等功效。臨床研究表明，它具有延緩衰老［1］、抗疲勞［2］的作用，對腦功能衰退［3］、性功能低下［4］、不孕不育［5］有治療效果，但其物質基礎研究薄弱。

中藥丸劑大多以飲片細粉形式直接入藥，一般配伍藥味多、輔料用量大，化學組成結構類型多、含量差異大。液質聯用技術具有強大的分離能力和結構鑒定的優勢［6］，通過對已知同類化合物的質譜裂解規律進行總結，可對未知化合物的結構進行合理推測。HPLC-LTQ-Orbitrap MS 可快速得到多級質譜碎片信息，提高中藥復雜體系中化學成分的快速鑒定與分析能力［7］。三重四極桿質譜中多反應監測（MRM） 模式的特異性和靈敏性使中藥微量成分的定性、定量分析成為可能，可彌補高分辨質譜的不足。

本研究基于HPLC-LTQ-Orbitrap MS、HPLCQQQ MS/MS 技術對至寶三鞭丸主要成分進行定性分析，明確該制劑化學組成，以期為其后續質量控制、藥效機制研究提供有力支撐。

1 材料

1.1 儀器 Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜-質譜系統，配置自動進樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機、四元泵、LTQ-Orbitrap 質譜檢測器（線性離子阱串聯靜電場軌道阱傅里葉變換高分辨質譜儀）、Xcalibur 3.0 工作站、Metworks 1.3、Mass Frontier 7.0 數據分析軟件（美國Thermo Fisher 公司）。高效液相色譜-質譜系統（美國AB Sciex 公司），配置 ExionLC-20AC 高效液相色譜儀、IonDriveTM Turbo V 離子源、Sciex 6500＋三重四極桿檢測器、Analyst 1.7 數據采集系統、MutiQuant 3.0.3 數據處理系統。SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）； KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 至寶三鞭丸（批號210403） 由煙臺中亞醫藥保健酒有限公司提供。毛蕊異黃酮對照品（批號SH18030505） 購自北京賽百草科技有限公司； 莫諾苷 （批號PRF21053101）、馬錢苷（批號PRF20051842）、23-乙酰澤瀉醇B （批號PRF21040201） 對照品均購自成都普瑞法科技開發有限公司； 阿魏酸（批號PS012244）、遠志口山酮Ⅲ（批號PS010505）、鞣花酸（批號PS020571）、β-蛻皮甾酮（批號PS000094）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷 （批號PS011341）、人參皂苷Re （批號PS011717）、人參皂苷Rb1 （批號PS011946）、人參皂苷Rg1 （批號PS010153）、丹皮酚 （批號PS000281）、淫羊藿苷（批號PS011515）、甘松新酮（批號 PS010660）、細葉遠志皂苷 （批號PS000954）、23-乙酰澤瀉醇C （批號PS012675）對照品均購自成都普思生物科技股份有限公司； 松脂醇二葡萄糖苷（批號MUST-21032510）、松果菊苷（批號MUST-21042513）、芍藥苷（批號MUST-21051210）、甘草苷 （批號MUST-21052114）、毛蕊花糖苷（批號MUST-20092315）、3，6′-二芥子酰基蔗糖（批號MUST-20062304）、甘草酸（批號MUST-20122305 ）、大 黃 素 （ 批 號 MUST-20092210）、大黃素甲醚（批號MUST-20072304）、毛蕊異黃酮苷 （批號MUST-21030920）、小檗堿（批號MUST-20073011）、蛇床子素（批號MUST-21041602）、黃芪甲苷（批號MUST-21031508） 對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司。BOND ELUTE C18、Bond Elut C18SPE 色譜柱均購自美國安捷倫公司； 甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純，購自賽默飛世爾生物化學制品（北京） 有限公司； 其余溶劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法

2.1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 分析條件

2.1.1 色譜 Waters BEH HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動相0.1% 甲酸水（A） -乙腈 （B），梯度洗脫 （0 ～10 min，2% ～23%B； 10 ～12 min，23% ～30% B； 12 ～30 min，30% ～95% B； 30.0 ～30.01 min，95% ～2% B；30.01～35.0 min，2%B）； 體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃； 進樣量2 μL。

2.1.2 質譜 電噴霧離子源（ESI）； 正負離子掃描； 碰撞氣超高純氦氣（He）； 霧化氣高純氮氣（N2）。正離子模式下的參數條件為毛細管溫度350 ℃，鞘氣 （N2） 體積流量60 arb，輔助氣（N2） 體積流量10 arb； 負離子模式下的參數條件為毛細管溫度350 ℃，鞘氣（N2） 體積流量35 arb，輔助氣（N2） 體積流量10 arb。一級質譜進行全掃描（分辨率30 000，m/z50 ～1 500），采用數據依賴性掃描獲得二級、三級質譜數據，動態離子排除模式獲得更多化合物信息（優化的參數條件為重復時間30 s； 排除列表大小50； 排除持續時間180 s）。

2.2 HPLC-QQQ MS/MS 分析條件

2.2.1 色譜 Waters BEH HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動相0.1% 甲酸水（A） -甲醇（B），梯度洗脫（0 ～9.0 min，20% ～95%B； 9.0 ～12.0 min，95%B； 12.0 ～12.01 min，95% ～20% B； 12.01 ～15.0 min，20% B）； 體積流量0.2 mL/min； 柱溫35 ℃； 進樣量2 μL。

2.2.2 質譜 電噴霧離子源（ESI）； MRM 模式；正負離子掃描； 氣簾氣（N2） 40 psi （1 psi＝6.895 kPa）； 碰撞氣 （N2） 9 psi； 噴霧電壓5 500 V（＋）、4 000 V （-）； 霧化溫度550 ℃； 霧化氣、輔助氣（N2） 55 psi； 駐留時間20 ms。

2.3 常規供試品溶液制備 取剪碎后的至寶三鞭丸約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入5 mL 75%甲醇，振搖至全部溶散，室溫超聲提取30 min，放涼，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.4 分段供試品溶液的制備 取剪碎后的至寶三鞭丸約5.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 純水，振搖至全部溶散，室溫超聲提取30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清液。Bond Elut C18SPE 色譜柱經甲醇活化和純水平衡后加入上清液，依次用水、30%甲醇、70%甲醇、甲醇進行洗脫，收集各部分洗脫液，減壓干燥，1 mL相應洗脫液復溶，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

3 結果

鑒定策略為①采用常規方法制備供試品溶液，進行高分辨質譜數據依賴性采集，鑒定離子碎片信息豐富的化學成分； ②采用極性分段方法制備供試品溶液，進行高分辨質譜數據依賴性采集，鑒定離子碎片信息中等的化學成分； ③進行HPLC-QQQMS/MS 靶向成分采集，可鑒定離子碎片信息較少的化學成分。首先利用①②獲得供試品色譜峰的精確相對分子質量，分析可能的元素組成，再利用其二級質譜碎片信息與文獻比對鑒定未知的化學成分，并進一步用對照品確認，最后利用自建的離子對庫與③獲得供試品的離子對信息進行比對，篩選未知的化學成分。

從至寶三鞭丸中鑒定得到82 個化合物，包括18 個有機酸類、17 個黃酮類、11 個萜類及皂苷類、8 個色原酮類、4 個苯乙醇苷類、3 個生物堿類、3 個香豆素類、2 個木脂素類、2 個蒽醌類，見圖1、表1～2。其中，72 個化合物通過高分辨質譜數據依賴性采集方法鑒定（占比88%），22 個通過采集靶向離子對的方式篩選，30 個通過與對照品進行比對而確認。

表1 HPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 所得至寶三鞭丸中化合物Tab.1 Compounds from Zhiabo Sanbian Pills by HPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS

表2 HPLC-QQQ MS/MS 法所得至寶三鞭丸中化合物Tab.2 Compounds from Zhiabo Sanbian Pills by HPLC-QQQ MS/MS

圖1 至寶三鞭丸色譜圖Fig.1 Chromatograms of Zhibao Sanban Pills

3.1 有機酸類 一級質譜中可見化合物9 （tR＝2.6 min） 的準分子離子峰m/z169.013 6（C7H5O5，［M-H］-，誤差2.84）。在二級質譜中可明顯看到丟失CO2的基峰信號m/z125.025 3（C6H5O3）。化合物20 （tR＝7.25 min） 的一級質譜中可見準分子離子峰m/z167.034 3 （C8H7O4，［M-H］-，誤差2.30）。在二級質譜中的基峰離子m/z152.011 5 （C7H4O4） 是丟失一分子CH3（15 Da） 而來，并可見丟失CO2（44 Da） 的碎片離子m/z123.045 4 （C7H7O2），m/z152 丟失CO2（44 Da） 生成碎片離子m/z108.021 8 （C6H4O2），推測化合物20 含有一分子甲氧基、一分子羧基。根據分子式和不飽和度以及文獻報道，推測化合物9、20 分別為3，4，5-三羥基苯甲酸（沒食子酸）、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸（香草酸）。

化合物19 在一級質譜中的準分子離子峰m/z179.034 4 （C9H7O4，［M-H］-，誤差3.10），二級質譜中出現失去一分子CO2生成的m/z135.045 8（C8H7O2） 基峰離子，并可見m/z135 失去一分子CO 生成的碎片離子m/z107.050 8 （C7H7O）。根據文獻［8-9］ 報道，推測化合物19 為3，4-二羥基肉桂酸（咖啡酸）。

化合物21 （tR＝7.8 min） 在一級質譜中的準分子離子峰m/z337.090 9 （C16H18O8，［M-H］-，誤差- 2.71）。在二級質譜中m/z191.056 5，173.045 9，155.035 3 的碎片離子與奎寧酸片段碎片離子一致，同時可見碎片離子m/z163.040 5，119.050 5，該部分與咖啡酸基團相差一個氧，推測為對香豆酰奎寧酸（pCoQA） 片段。根據文獻［8-9］ 報道，推斷化合物21 為對香豆酰基奎寧酸。

化合物17 （tR＝6.47 min） 在一級質譜中的準分子離子峰m/z353.086 1 （C16H17O9，［M-H］-，誤差-1.75）。在二級質譜中可明顯看到基峰信號m/z191.057 3 （C7H11O6），這是丟失咖啡酰基團后的奎寧酸基團，進一步失去H2O，生成脫水奎寧酸基團碎片離子m/z173.046 3 （C7H9O5）。二級質譜中同時可見質量數為m/z179.035 9（C9H7O4） 的咖啡酸基團，m/z179 失去一分子CO2生成m/z135.045 9 （C8H7O2） 的脫羰基咖啡酸基團碎片離子。化合物18 的準分子離子和碎片離子與化合物17 一致，根據文獻［10-11］ 報道，推測化合物17～18 分別為新綠原酸、隱綠原酸。

3.2 香豆素類 化合物60 （tR＝19.23 min） 在一級質譜中的準分子離子峰m/z367.116 7（C21H19O6，［M-H］-，誤差-2.49）。二級質譜中可見碎片離子m/z352.096 6 （C20H16O6），與［M-H］-對比發現是由于甲氧基斷裂失去一分子CH3生成，碎片離子m/z309.041 3 （C17H9O6） 的豐度最高，是同時失去CH3和C3H7而來，其中C3H7來自異戊烯基鏈。三級質譜中可見中性小分子碎片（CO、CO2） 的丟失，由m/z309 生成的碎片離子m/z281.046 9 （C16H9O5）、m/z265.051 5（C16H9O4） 分別是丟失一分子CO、CO2。根據文獻［12］ 報道，推測化合物60 為甘草香豆素。

3.3 環烯醚萜類 化合物13 （tR＝4.5 min） 在一級質譜中的準分子離子峰m/z373.111 9（C16H21O10，［M-H］-，誤差-2.88），二級質譜中可檢測到糖苷鍵斷裂失去一分子葡萄糖（C6H10O5，162 Da） 生成的離子m/z211.061 8 （C10H11O5），碎片離子m/z355.103 4 （ C16H19O9）、m/z329.124 5 （C15H21O8） 是［M-H］-中性丟失H2O（18 Da）、CO2（44 Da） 而生成的，還可檢測到碎片離子m/z193.050 8 （C10H9O4），167.071 9（C9H11O3），149.061 3 （C9H9O2），分別是m/z211 失去H2O、CO2、H2O、CO2得到。失去葡萄糖基的m/z211 離子發生半縮醛結構異構化，導致二氫吡喃環開裂，形成含有2 個醛基結構的異構體，C5-C4鍵斷裂失去C3H4O3（88 Da） 產生豐度很高的離子m/z123.045 6 （C7H7O2）。根據文獻［13］ 報道，推測化合物13 為京尼平苷酸。

3.4 苯乙醇苷類 化合物32、36 分別在保留時間10.76、11.32 min 處出現準分子離子峰m/z623.194 0 （C29H35O15，［M-H］-，誤差-4.94）、m/z623.194 2 （ C29H35O15，［M-H］-，誤差-4.55）。化合物32 二級質譜（圖2） 中出現豐度最高的碎片離子m/z461.167 9 （C20H29O12） 是由酯鍵斷裂失去一分子咖啡酰基（C9H6O3，162 Da）生成，同時可見糖苷鍵斷裂失去一分子鼠李糖（C6H10O4，146 Da） 產生的碎片離子m/z477.140 7（C23H25O11），失去一分子3，4 二羥基苯乙基（C8H8O2，136 Da） 而生成的碎片離子m/z487.146 4 （C21H27O13），以及糖苷鍵斷裂后的咖啡酰氧基部分的碎片離子m/z179.035 7 （C9H7O4）。m/z461 失去一分子H2O （18 Da） 生成碎片離子m/z443.157 3 （C20H27O11），再失去一分子鼠李糖生成碎片離子m/z315.109 6 （C14H19O8），最后失去一分子H2O 生成碎片離子m/z297.098 7（C14H17O7）。根據文獻［14］ 報道，推測化合物32、36 為毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷。

圖2 化合物32 在負離子模式下的MS2 質譜圖Fig.2 MS2 mass spectrogram of compound 32 in negative ion mode

3.5 黃酮類 化合物27 （tR＝9.98 min） 一級質譜中的準分子離子峰m/z431.095 9 （C21H19O10，［M-H］-，誤差- 3.14），二級質譜中可見m/z341.067 5 （C18H13O7，［M-H-C3H6O3］-），m/z311.056 5 （C17H11O16，［M-H-C4H8O4］-） 的碎片離子，符合黃酮六碳糖苷糖基部分C-3 位開裂丟失C3H6O3（90 Da）、六碳糖C-2 位開裂丟失C4H8O4（120 Da） 特征碎片峰的規則，推測其分子結構中連有1 個六碳糖。根據文獻［15］ 報道，推測化合物27 為牡荊素。

化合物47 經對照品指認確定為毛蕊異黃酮，正負離子模式下響應均很高。在負離子模式下保留時間為14.14 min 的一級質譜中準分子離子峰m/z283.059 6 （C16H11O5，［M-H］-，誤差-1.77），二級質譜中出現由于甲氧鍵斷裂丟失一分子CH3（15 Da） 產生的二級碎片離子m/z268.039 3（C15H8O5），三級質譜中出現由碎片離子m/z268失去一分子CO 而生成的基峰離子m/z240.043 9（C14H8O4），同時可見碎片離子m/z224.048 7（C14H8O3），211.040 9 （C13H7O3），195.045 9（C13H7O2），184.053 7 （C12H8O2），均是由分子量為m/z268 的離子失去CO、CO2中性小分子而生成。C 環發生0/3 裂解，0，3A-部分生成碎片離子m/z120.022 3 （C7H4O2），0，3B-部分生成碎片離子m/z148.017 3 （C8H4O3）。根據文獻［16］ 報道，推測化合物47 為毛蕊異黃酮。

化合物44 （tR＝13.13 min） 一級質譜中的準分子離子峰m/z417.116 8 （C21H21O9，［M-H］-，誤差-2.85）。糖苷鍵斷裂失去葡萄糖基生成苷元m/z255.066 9 （C15H11O4）。苷元C 環發生逆狄爾斯-阿爾德（RDA） 裂解后產生的碎片離子與甘草素碎片離子m/z153.020 0，m/z135.009 1，m/z119.050 8，m/z91.019 4 一致。根據文獻［17］ 報道，推測化合物44 為甘草苷。

化合物52 （tR＝16.59 min） 一級質譜中出現分子量為m/z255.065 4 （C15H11O4，［M-H］-，誤差0.72） 的準分子離子峰，二級質譜中出現由RDA 裂解1，3A-部分生成的碎片離子m/z135.009 2（C7H3O3），同時可見1，3B-部分生成的碎片離子m/z119.050 6 （C8H7O）。碎片離子m/z135 失去一分子CO2，生成離子m/z91.019 2 （C6H3O）。根據文獻［17］ 報道，推測化合物52 為甘草素。

3.6 蒽醌類 化合物66 （tR＝20.87 min） 一級質譜中的準分子離子峰m/z269.044 5 （C15H9O5，［M-H］-，誤差0.15），二級質譜中出現由于丟失一分子CO2（44 Da） 產生的二級碎片離子m/z225.057 0 （C14H9O3），同時可見由［M-H］-失去一分子CO 而生成的碎片離子m/z241.051 6（C14H9O4），以及m/z225.057 0 失去一分子CO 而生成的碎片離子m/z197.061 6 （C13H9O2）。查閱相關文獻及與對照品比對，確定化合物66 為大黃素。

3.7 內酯類 化合物45 （tR＝13.39 min） 一級質譜中的準分子離子峰m/z249.147 3 （C15H21O3，［M＋H］＋，誤差-4.82），二級質譜（圖3） 中可見由于丟失一分子H2O （18 Da） 分子量為m/z231.138 0 （C15H19O2） 的基峰離子，m/z231.138 0 失去一分子H2O 生成碎片離子m/z213.127 5（C15H17O），［M＋H］＋失去C2H4O2生成碎片離子m/z189.127 3 （C13H17O）。根據文獻［18］ 報道，推測化合物45 為白術內酯Ⅲ。

圖3 化合物45 在正離子模式下的MS2 質譜圖Fig.3 MS2 mass spectrogram of compound 45 in positive ion mode

4 討論與結論

針對至寶三鞭丸化學組成復雜而微量的特點，本研究建立了一種綜合的化學成分鑒定策略，包含不同極性分段供試品制備技術、高分辨質譜數據依賴性采集、靶向成分采集等，可分別鑒定在質譜中離子碎片信息較少、信息中等及信息豐富等不同的化學成分。目前，靶向采集的篩選策略已用于高通量、高靈敏性的代謝性小分子的組學研究中［19］，利用三重四極桿質譜靈敏度高的優勢，可對復方中低豐度的化合物進行鑒定。結果，共鑒定出黃酮類、萜類及皂苷類、有機酸類、色原酮類、苯乙醇苷類、酚類、香豆素類、生物堿類、蒽醌類、木脂素類、內酯類等十余種結構類型的82 個化合物，覆蓋了至寶三鞭丸中大多數藥味的化學成分。

課題組前期已綜合利用HPLC 指紋圖譜、HPLC-MS/MS 等對16 批至寶三鞭丸進行分析，建立了同時測定34 種成分含量的方法，評價一致性及中藥制劑-血漿-腦組織-腦脊液的轉移分析，結合本研究的定性結果可進一步篩選其“制劑質量標志物”［20-21］，這是針對大復方中藥丸劑篩選制劑質量控制指標的一種嘗試。

綜上所述，本實驗為至寶三鞭丸“制劑質量標志物”［22-24］篩選提供了初步數據，為進一步開展該制劑全面質量控制、藥效機制研究提供了有力支撐，同時為其他中藥丸劑物質基礎研究提供了參考。