窄孢靈芝化學(xué)成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

霍雅琴，王雨曦，魏玉蓮，張怡軒，袁海生*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016； 2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，中國(guó)科學(xué)院森林生態(tài)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

靈芝又稱為瑞草、萬(wàn)年蕈［1］，是靈芝屬真菌的統(tǒng)稱，屬于擔(dān)子菌亞門(mén)多孔菌目多孔菌科靈芝屬［2］，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國(guó)及一些亞洲其他國(guó)家廣泛使用，被認(rèn)為具有保健、延年益壽的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有抗氧化［3］、抗腫瘤［4］、保肝［5］等作用，臨床上用來(lái)治療慢性支氣管炎［6］和一些呼吸道疾病［7］、糖尿病［8］、高血壓［9］、腫瘤輔助治療［10］等。靈芝屬物種豐富，分布廣泛，主要分布在貴州、云南、福建、廣西等地［11］。現(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，靈芝含有多糖、三萜、生物堿、甾體等［12］，以三萜為主［13］。目前，已經(jīng)有103 種靈芝被報(bào)道，但研究重點(diǎn)主要聚集于赤芝、紫芝、樹(shù)舌靈芝等物種［14］，其他物種比較缺乏。窄孢靈芝是2018 年發(fā)現(xiàn)的新品種［15］，目前對(duì)其化學(xué)成分和藥理活性尚未進(jìn)行報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)窄孢靈芝的化學(xué)成分和α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究，共分離得到7 個(gè)化合物，其中化合物1 為新天然產(chǎn)物，2～7 為首次從靈芝屬中分離得到，1～2、4 ～7 都表現(xiàn)出了一定程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 材料

Bruker 600 型超導(dǎo)核磁共振光譜儀 （德國(guó)Bruker 公司）； Q ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀、TSQ Quantum Access MAX 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）； LC-20AT 島津制備液相色譜儀（日本島津公司）； 安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；制備型色譜柱（250 mm×20 mm，10 μm）、半制備型色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm） （日本YMC 公司）。薄層析硅膠（青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司）。窄孢靈芝于2018 年采自福建省平潭縣，經(jīng)北京林業(yè)大學(xué)戴玉成教授鑒定為窄孢靈芝Ganoderma angustisporumJ.H.Xing，B.K.Cui ＆ Y.C.Dai［16］，現(xiàn)保存于中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所東北生物標(biāo)本館。

α-葡萄糖苷酶（批號(hào)RM20Y1225）、pNPG （批號(hào)RM20Y1118）、阿卡波糖（批號(hào)RT20U1210） （上海瑞永生物科技有限公司）。

2 提取與分離

采用PDA 培養(yǎng)基，將窄孢靈芝擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，制備種子培養(yǎng)液，取5 mL 接入大米培養(yǎng)基，在28 ℃下靜置培養(yǎng)2 個(gè)月，直至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基。菌絲培養(yǎng)物加入乙酸乙酯，于室溫下浸泡提取，濃縮后得到靈芝浸膏170 g，經(jīng)減壓硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯（50 ∶1 ～1 ∶1） 和二氯甲烷-甲醇（50 ∶1 ～1 ∶1） 梯度洗脫，TLC、HPLC 檢識(shí)合并，得到Fr.A～Fr.D。

Fr.B （35 g） 經(jīng)ODS 柱層析分離，以20% ～100%甲醇梯度洗脫，得到Fr.B1 ～Fr.B4。Fr.B1（1.2 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1 ～5 ∶1） 梯度洗脫，經(jīng)TLC、制備HPLC 純化，以75%甲醇洗脫（體積流量7 mL/min），37%乙腈洗脫（體積流量0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210、254 nm），再經(jīng)半制備HPLC 純化，以45% 乙腈洗脫（體積流量2.5 mL/min），得到化合物7 （55.2 mg，tR＝19 min）。Fr.B2 （2.02 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1 ～5 ∶1） 梯度洗脫，經(jīng)TLC、制備HPLC 純化，以45%甲醇洗脫（體積流量7 mL/min），27% 乙腈洗脫（體積流量0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210、254 nm），合并相似組分，再經(jīng)半制備HPLC 純化，以20% 乙腈洗脫（體積流量2.5 mL/min），得到化合物1 （10.6 mg，tR＝47 min）、2 （7.5 mg，tR＝ 39 min）。Fr.B3（1.04 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1～5 ∶1） 梯度洗脫，經(jīng)TLC、制備HPLC 純化，以30%甲醇洗脫（體積流量7 mL/min），45%乙腈洗脫（體積流量0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210、254 nm），合并相似組分，再經(jīng)半制備HPLC 純化，以25%乙腈洗脫（體積流量2.5 mL/min），得到化合物6 （100.3 mg，tR＝30 min）。Fr.B4 （1.5 g） 經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1 ～5 ∶1）梯度洗脫，合并相似組分，得到Fr.B4-1 ～Fr.B4-5，經(jīng)TLC、制備HPLC 純化，以78% 甲醇洗脫（體積流量7 mL/min），再經(jīng)HPLC 純化，以70%乙腈洗脫（體積流量0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210、254 nm），合并相似組分，經(jīng)半制備HPLC 純化，以70%乙腈洗脫（體積流量2.5 mL/min），得到化合物3 （0.6 mg，tR＝20 min）、4 （2.1 mg，tR＝31 min）、5 （1.8 mg，tR＝26 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compound 1

由1H-1H COSY 譜可知，該化合物有3 個(gè)自旋系統(tǒng)，同時(shí)有H-5 ～9 相關(guān)信號(hào)，表明存在1 個(gè)苯環(huán)。由HMBC 譜可知，-NH 與C-2′相關(guān)，H-1′與C-2′相關(guān)，表明羰基與C-2′相連，C-2′和-NH、C-1′相連； H-2 與C-1、C-4 相關(guān)，H-3 與C-9 相關(guān)，表明苯環(huán)與1 個(gè)亞甲基相連，C-2 與1 個(gè)羰基碳相連； H-10 與C-1、C-11 存在遠(yuǎn)程相關(guān)，表明亞甲氧基連在C-1 上，平面結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。再以HMBC和1H-1H COSY 譜進(jìn)行驗(yàn)證，見(jiàn)圖2。

圖2 化合物1 關(guān)鍵1H-1H COSY 和HMBC 相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlation of compound 1

化合物1 的絕對(duì)構(gòu)型是通過(guò)計(jì)算ECD 確定，結(jié)果顯示2S的ECD 圖譜與化合物1 實(shí)測(cè)圖譜有相同的Cotton 效應(yīng)，從而確定其絕對(duì)構(gòu)型為2S（圖3）。以上與文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道基本一致，確定為新天然產(chǎn)物，鑒定為N-acetyl-L-phenylalanine ethyl ester。

圖3 化合物1 實(shí)驗(yàn)、計(jì)算ECD 比較Fig.3 Comparison of experimental and calculated ECDs for compound 1

化合物2： 白色粉末，ESI-MSm/z： 222.1［M＋H］＋，分子式C12H15NO3。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 7.29 （ 2H，m，H-3′，5′），7.25（1H，d，J＝7.4 Hz，H-4′），7.09 （2H，m，H-2′，6′），5.90 （1H，d，J＝7.8 Hz，-NH），4.89（1H，dt，J＝7.8，5.8 Hz，H-2），3.73 （3H，s，1-OCH3），3.15 （1H，dd，J＝13.9，5.9 Hz，H-3a），3.10 （1H，dd，J＝13.9，5.7 Hz，H-3b），1.99 （ 3H，s，H-1″）；13C-NMR （ 150 MHz，CDCl3）δ： 172.2 （C-1），169.7 （C-2″），135.9（C-1′），129.4 （C-3′，5′），128.7 （C-2′，6′），127.3 （C-4′），53.2 （C-2），52.5 （1-OCH3），38.0 （C-3），23.3 （C-1″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為N-acetyl-Lphenylalanine methyl ester。

化合物3： 無(wú)色油狀物，ESI-MSm/z： 333.3［M＋H］＋，分子式C21H32O3。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 5.64 （1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），5.26 （1H，dd，J＝15.2，7.8 Hz，H-16），5.17（1H，dd，J＝15.3，8.5 Hz，H-15），2.63 （1H，m，H-8），2.27 （1H，ddd，J＝14.3，4.2，2.4 Hz，H-5a），2.06 （1H，q，J＝8.6 Hz，H-13），1.98 （1H，ddd，J＝13.4，4.7，2.5 Hz，H-17），1.91 （1H，m，H-6a），1.88 （1H，m，H-5b），1.86 （1H，d，J＝5.9 Hz，H-10a），1.73 （1H，m，H-9a），1.63 （1H，td，J＝13.5，4.2 Hz，H-6b），1.48 （1H，m，H-9b），1.47 （1H，m，H-11），1.46 （1H，m，H-18），1.04 （3H，d，J＝6.7 Hz，H-14），0.92 （3H，d，J＝6.8 Hz，H-21），0.84 （3H，d，J＝6.8 Hz，H-19），0.83（3H，d，J＝6.8 Hz，H-20），0.61 （3H，s，H-12）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 170.8 （C-1），170.5 （C-3），134.8 （C-15），133.0 （C-16），112.5 （C-2），104.8 （C-4），55.5 （C-11），50.5 （C-8），49.0 （C-7），43.0 （C-17），40.3（C-13），35.4 （C-5），35.2 （C-6），33.2 （C-18），29.0 （C-10），21.5 （C-9），21.2 （C-14），20.1 （C-20），19.8 （C-19），17.7 （C-21），11.9（C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為4-hydroxy-17R-methylincisterol。

化合物4： 黃色固體，ESI-MSm/z： 397.1［M＋H］＋，分子式C22H20O7。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 13.56 （1H，s，1-OH），7.47 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-5），7.22 （1H，s，H-4），6.79（1H，d，J＝2.5 Hz，H-7），5.38 （1H，d，J＝4.4 Hz，H-1′），4.02 （ 3H，s，H-11），3.98（3H，s，H-12），2.08 （1H，m，H-2′a），2.04（1H，m，H-4′a），1.88 （1H，m，H-2′b），1.83（1H，m，H-4′b），1.65 （2H，m，H-3′），1.57（3H，s，H-6′）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ：187.0 （ C-9），182.8 （ C-10），165.1 （ C-6），163.0 （ C-8），159.7 （ C-3），159.6 （ C-1），137.8 （C-5a），132.7 （C-4a），117.0 （C-2），115.5 （C-8a），110.0 （C-1a），107.2 （C-4），105.0 （ C-7），104.1 （ C-5），101.0 （ C-5′），67.2 （C-1′），56.8 （C-11），56.2 （C-12），36.1（C-4′），28.0 （C-6′），27.6 （C-2′），16.2 （C-3′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為6，8-di-O-methylaverufin。

化合物5： 黃色固體，ESI-MSm/z： 369.3［M＋H］＋，分子式C20H17O7。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 13.51 （1H，s，1-OH），7.46 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-5），7.23 （1H，s，H-4），6.79（1H，d，J＝2.5 Hz，H-7），6.46 （1H，d，J＝5.7 Hz，H-1′），4.15 （2H，q，J＝8.3，7.7 Hz，H-2′，4′），4.03 （3H，s，8-OCH3），3.98 （3H，s，6-OCH3），2.37 （1H，dd，J＝12.6，4.9 Hz，H-3′），2.27 （1H，tt，J＝12.4，8.3 Hz，H-3′）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 187.3 （C-9），182.7 （C-10），165.3 （C-3），165.2 （C-6），163.0 （C-8），160.4 （C-1），137.7 （C-10a），135.1 （C-4a），120.3 （C-2），115.1 （C-8a），113.1 （ C-1′），112.8 （ C-9a），105.0 （ C-7），104.3 （C-5），101.3 （C-4），67.9 （C-4′），56.8（8-OCH3），56.2 （6-OCH3），44.6 （C-2′），30.9（C-3′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［20］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為aversin。

化合物6： 無(wú)色油狀，ESI-MSm/z： 167.1［M＋H］＋，分子式C8H7NO。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 7.05 （2H，d，J＝8.5 Hz，H-2′，6′），6.71 （2H，d，J＝8.5 Hz，H-3′，5′），3.59（1H，s，-OCH3），3.53 （1H，s，H-2）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ： 172.1 （C-1），156.3（ C-4′），130.3 （ C-2′，6′），124.5 （ C-1′），115.2 （C-3′，5′），51.6 （-OCH3），39.4 （C-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為methyl 2- （4-hydroxyphenyl） acetate。

化合物7： 白色結(jié)晶，ESI-MSm/z： 147.1［M＋Na］＋，分子式C7H8O2。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 6.41 （1H，brs，H-6），6.40 （1H，brs，H-4），6.30 （1H，brs，H-2），2.27 （3H，s，H-7）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 156.3（C-1），103.4 （C-2），157.7 （C-3），111.3 （C-4），141.0 （C-5），111.8 （C-6），21.2 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［22］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為5-甲苯-1，3-二醇。

4 α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

參考文獻(xiàn) ［23］ 報(bào)道，將各化合物稀釋至200、100、50、25、5 μmol/L，于96 孔板上分別加入各化合物25 μL、PBS 125 μL、α-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL） 25 μL，在37 ℃下反應(yīng)10 min 后加入底物pNPG 2.5 mmol/L，平行3 次，繼續(xù)反應(yīng)30 min，在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1； 取等體積PBS 代替α-葡萄糖苷酶，平行3 次，在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A2； 取等體積PBS 代替化合物，在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A3； 取等體積PBS 代替化合物和α-葡萄糖苷酶，在405 nm 處測(cè)定吸光度A4，以200、100、50、25、5 μmol/L 阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，平行3 次，取平均值，計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率和IC50值，公式為抑制率＝ ｛ ［（A3-A4） - （A1-A2）］ /（A3-A4） ｝ ×100%。結(jié)果，化合物1～2、4 ～7 都表現(xiàn)出了一定程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值分別為（33.80±0.47）、（45.45±7.95）、（48.80±5.86）、（39.48±2.82）、（41.47±6.68）、（55.38±10.12） μmol/L，見(jiàn)圖4，其中化合物1 的抑制活性較強(qiáng)。

圖4 各化合物α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.4 α-Glucosidase inhibitory activities of various constituents

5 結(jié)論

本研究從窄孢靈芝Ganodermaangustisporum中分離得到了7 個(gè)化合物，其中化合物1 為新天然產(chǎn)物，化合物2 ～7 為首次從靈芝屬中分離得到。再對(duì)上述化合物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，結(jié)果顯示化合物1 作用較強(qiáng)。靈芝具有許多藥理作用，尤其在降血糖等方面應(yīng)用前景廣闊，但目前對(duì)窄孢靈芝化學(xué)成分和藥理活性尚未進(jìn)行報(bào)道，故無(wú)論在新藥開(kāi)發(fā)還是在保健產(chǎn)品研制過(guò)程中，都需要對(duì)上述方面進(jìn)行系統(tǒng)考察，以期為其潛在應(yīng)用提供依據(jù)。