黑豆與黃酒共制女貞子炮制工藝優化

蔣云秀，東寶花，敖明月，胡 麟，胡昌江，陳志敏，余凌英

（成都中醫藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137）

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、明目烏發的功效，臨床常用于治療肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白、目暗不明、內熱消渴、骨蒸潮熱等，而黑豆可用于預防心血管疾病、治療糖尿病、抗炎癥、改善骨質疏松等［1］。女貞子生品性涼，臨床應用時有輕微腹痛、腹瀉等不良反應［2］，需加以炮制［3］，如黃酒制可緩和其寒性，黑豆汁制可協同增強其補肝腎、抗氧化等作用［4］，傳統炮制方法為黑豆與其共蒸，但因時間較長、工藝參數無量化標準、大生產篩選繁瑣，限制了其傳承發展［5］。因此，本實驗采用星點設計-響應面法，通過“性狀-成分-藥效” 多維評價優化黑豆與黃酒共制女貞子炮制工藝，以期為該藥材規范化生產和臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Thermo 2018 型高效液相色譜系統（美國Thermo 公司）； BP110S 型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）； DHS-10A 型快速水分測定儀［邦西儀器科技（上海） 有限公司］； DHG-9240 型電熱鼓風干燥箱（上海索譜儀器有限公司）； HH-S8 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）； KQ-300E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 紅景天苷（批號CHB20101）、特女貞苷（批號CHB201213）、女貞苷G13 （批號CHB210106）、2，2 聯苯基-1-苦基肼基 （DPPH，批號CHB210105）、2，2-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批號AA0400） 對照品均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均大于98%。黃酒購自紹興市抱龍山有限公司； 黑豆購自農貿市場（大粒綠心黑豆）。女貞子（批號D2110016、D2010050、D220526） 購自四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，經成都中醫藥大學藥學院胡昌江教授鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實。過硫酸鉀（2021110101）。乙腈、磷酸均為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 炮制品制備

2.1.1 傳統方法 取100 g 女貞子，加入20 g黃酒，拌勻，悶潤，加入等量黑豆粒，隔水蒸制一段時間，取出，干燥，重復9 次，即得。

2.1.2 優化方法 取100 g 女貞子，加入適量黃酒和黑豆汁隔水蒸制一段時間，取出，干燥，重復1 次，即得。

2.1.3 黃酒黑豆汁制備方法 取100 g 黑豆，加水煎煮2 次，第1 次4 h，第2 次3 h，過濾，合并濾液，得250 mL 黑豆汁，晾涼后加入20 mL 黃酒，即得。

2.2 外觀評價標準建立 根據成品性狀結合2020年版《中國藥典》，以表面色澤、質地、氣味為評價指標［6］，具體見表1。

表1 女貞子外觀評價標準Tab.1 Appearance evaluation criteria for Ligustri lucidi Fructus

2.3 醇溶性浸出物含量測定 參考2020 年版《中國藥典》，采用醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法，以30%乙醇為溶劑，要求不得少于25%。

2.4 含量測定 采用HPLC 法。

2.4.1 色譜條件 Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫（0 ～10 min，10% 乙腈； 10 ～60 min，10% ～40%乙腈）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃；檢測波長275 nm； 進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 對照品適量，50%甲醇定容至刻度，制成質量濃度分別為0.078、2.26、1.52 mg/mL 的溶液，即得，在4 ℃下保存。

2.4.3 供試品溶液制備 精密稱取1.0 g 女貞子粉末（過3 號篩），置于錐形瓶中，精密加入25 mL 稀乙醇，稱定質量，密塞，超聲提取40 min，取出，放冷，稀乙醇補足減失的質量，靜置，取適量上清液，3 000 r/min 離心20 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 線性關系考察 精密吸取不同體積對照品溶液，50%甲醇稀釋，在“2.4.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，在“2.4.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 峰面積RSD 分別為0.38%、0.91%、1.35%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（S1），于0、4、8、12、24、48 h 在“2.4.1” 項色譜條件下進樣測定，測得紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 峰面積RSD 分別為1.97%、1.27%、0.62%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。

2.4.4.4 重復性試驗 精密稱取藥材（S1） 6 份，按 “2.4.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1” 項色譜條件下進樣測定，測得紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 峰面積RSD 分別為1.03%、1.70%、0.75%，表明該方法重復性良好。

2.4.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的藥材粉末0.01 g，置于錐形瓶中，精密加入對照品適量，按“2.4.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13平均加樣回收率分別為101.73%、100.84%、97.89%，RSD 分別為2.89%、2.34%、2.28%。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 供試品溶液制備 同“2.4.3” 項。

2.5.2 DPPH 法 參考文獻［7］ 報道，精密稱取DPPH 2.75 mg，置于100 mL 量瓶中，無水乙醇溶解定容，制成質量濃度為0.027 5 mg/mL 的溶液。取“2.4.3” 項下供試品溶液1 mL，與3 mL DPPH溶液混勻，避光反應30 min，在517 nm 波長處測定吸光度A，以樣品溶劑調零校準，計算DPPH 清除率，公式為清除率＝ ［1- （A1-A2） /A3］ ×100%，其中A1為1 mL 供試品溶液與3 mL DPPH溶液混合室溫避光孵育30 min 后吸光度，A2為1 mL供試品溶液與3 mL 無水乙醇混合室溫避光孵育30 min 后吸光度，A3為1 mL 稀乙醇與3 mL DPPH 溶液混合室溫避光孵育30 min 后吸光度。

2.5.3 ABTS 法 參考文獻 ［8］ 報道，ABTS溶液由ABTS （3.84 mg/mL） 與過硫酸鉀（1.34 mg/mL） 等體積混合而成，避光放置12 h，使用時用無水乙醇稀釋至吸光度為0.70 ± 0.02。取“2.4.1” 項下供試品溶液0.2 mL，與3.8 mL ABTS 溶液混勻，避光反應5 min，在734 nm 波長處測定吸光度A，以樣品溶劑調零校準，計算ABTS 清除率，公式為清除率＝ （1-As/Ab） ×100%，其中Ab為3.8 mL ABTS 溶液＋0.2 mL 樣品溶液吸光度，As為3.8 mL ABTS 溶液＋0.2 mL 樣品溶液吸光度。

2.6 權重確定 參考文獻［9］ 報道，采用層次分析法（AHP）。

浸出物是質量控制的重要指標，而特女貞苷、紅景天苷、女貞苷G13 為女貞子中含量較高、具有變化趨勢的成分。同時，特女貞苷、紅景天苷作為2020 年版《中國藥典》 女貞子質量控制的指標成分，在炮制過程中可發生轉化； 女貞苷G13 含量較高，并具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用［10-11］。因此，本實驗選擇醇溶性浸出物、特女貞苷、紅景天苷、女貞苷G13 含量作為評價指標。

將3 個影響因素分為3 個層次，4 個評價指標分為4 個層次，確定重要程度依次為成分＞藥效＞性狀、紅景天苷含量＞女貞苷G13 含量＞特女貞苷含量＞醇溶性浸出物含量，采用1～9 標度法對其進行兩兩比較以評判重要性［12-13］，構建成對比較優先判斷矩陣，見表3～5。

表3 各層次評分標準Tab.3 Scoring standards for various levels

表4 性狀、成分、藥效成對比較優先判斷矩陣及權重系數Tab.4 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of characters，components and efficacy

表5 評價指標成對比較優先判斷矩陣及權重系數Tab.5 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of evaluation indices

根據評分結果，測得性狀、成分、藥效一致性比例因子（CR） ＝0.008 9＜0.1，而紅景天苷、女貞苷G13、特女貞苷、醇溶性浸出物含量CR ＝0.011 6＜0.1，均符合一致性檢驗，表明權重系數合理有效。

2.7 黑豆與黃酒共制女貞子工藝優化

2.7.1 單因素試驗

2.7.1.1 輔料 傳統炮制方法是女貞子與黑豆共蒸，但兩者難以區分，篩選起來耗時費力，而且九制女貞子耗時較長，不適宜大生產，故本實驗選擇黑豆汁。

2.7.1.2 蒸制時間 隨著蒸制時間延長，紅景天苷含量升高，女貞苷G13、特女貞苷含量先升后降，在60 min 時最高，結合蒸制次數，本實驗選擇60 min。

2.7.1.3 蒸制次數 隨著蒸制次數增加，紅景天苷含量升高，女貞苷G13、特女貞苷含量呈動態變化，在第5 次時最高，故本實驗選擇5 次。

2.7.1.4 烘制溫度 隨著烘制溫度增加，紅景天苷含量升高，特女貞苷、女貞苷G13 含量降低，綜合考慮，本實驗選擇80 ℃。

2.7.2 星點設計-響應面法 在單因素試驗基礎上，以蒸制時間（A）、蒸制次數（B）、烘制溫度（C） 為影響因素，設計三因素五水平試驗，因素水平見表6。

表6 星點設計-響應面法因素水平Tab.6 Factors and levels for central composite designresponse surface method

然后，以外觀性狀，紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13、醇溶性浸出物含量，DPPH、ABTS 自由基清除率的總評 “歸一值” （OD 值） 為評價指標［14-15］，公式為OD＝0.539 0×［0.465 8×Y1/Y1max＋0.277 1×Y2/Y2max＋0.161 1×Y3/Y3max＋0.096 0×Y4/Y4max］ ＋0.297 3× ［0.5×Y5/Y5max＋0.5×Y6/Y6max］ ＋0.163 8×Y7/Y7max，其中Y1～Y7分別為紅景天苷、女貞苷G13、特女貞苷、醇溶性浸出物含量，DPPH、ABTS 自由基清除率，外觀性狀，Y1max～Y7max為其最大值，結果見表7。

表7 星點設計-響應面法設計與結果Tab.7 Design and results for central composite design-response surface method

采用Design Expert 8.0 軟件對表7 數據進行二次多元回歸擬合，得方程為OD ＝0.80 ＋6.50A＋1.88B＋0.02C-1.39AB-8.29AC＋4.59BC＋9.97C2，方差分析見表8。由此可知，模型P＜0.05，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明該模型可用于預測分析； 烘制溫度具有顯著影響（P＜0.05）。響應面分析見圖2。

圖2 各因素響應面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

最終確定，最優工藝為黑豆熬汁約250 g 后加入20 g 黃酒，拌入100 g 女貞子中，隔水共蒸70 min，取出，在90 ℃下烘干，拌入黑豆汁與黃酒再蒸，重復7 次。

2.7.3 驗證試驗 取3 批藥材（批號D2110016、D2010050、D220526），按“2.7.2” 項下優化工藝進行驗證試驗，結果見表9。由此可知，該工藝穩定可行（RSD＜3%）。

表9 驗證試驗結果（n＝3）Tab.9 Results for verification tests （n＝3）

3 討論與結論

2020 年版《中國藥典》 僅收載了女貞子和酒女貞子，而黑豆與黃酒共制女貞子在古籍中記載較多，不僅能減少其不良反應，還可增強其滋補肝腎作用，但耗時較長，不適宜現代化生產，故本實驗采用星點設計-響應面法探索更規范化、數據化的炮制工藝。現代研究表明，女貞子中紅景天苷、特女貞苷、女貞苷G13 具有抗炎、抗氧化、調節免疫等藥理活性［16-19］，故本實驗以性狀、成分和藥效為指標，結合層次分析法確定其權重，避免主觀化對結果的影響，發現最優工藝下上述指標與傳統炮制方法相似，在某些方面甚至更優，可實現特色炮制品的數據化生產［20-21］。

綜上所述，本實驗不僅為女貞子現代化生產提供了依據，還通過建立“性狀-成分-藥效” 多維關聯的炮制工藝優化方法來為其他中藥炮制品提供了借鑒。今后，將進一步探索女貞子特色炮制品的藥效物質變化情況，深入挖掘其作用機制，以期更有利于相關臨床應用和產品開發。