黃芩莖葉葡萄糖醛酸水解酶提取工藝、酶學性質、實際應用研究

程雨婕，陳 旭，劉云華，黃志芳，陳 燕，劉玉紅，易進海*

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611130； 2.四川省中醫藥科學院，中藥材品質及創新中藥研究四川省重點實驗室，四川 成都 610041）

黃芩主要有效成分為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮，其中黃芩素較黃芩苷有更強的生物活性，而且更易吸收，生物利用度更高［1-3］，故從黃芩中直接提取該成分具有更好的藥用價值。黃芩存在葡萄糖醛酸水解酶，主要催化黃芩苷水解形成黃芩素，屬于糖基水解酶家族79［4］，被命名為黃芩酶。課題組前期報道從黃芩中提取黃芩酶以酶解黃芩苷類成分，制備黃芩素和總苷元［5］，本實驗在此基礎上從黃芩莖葉這一地上部分廢棄物中提取葡萄糖醛酸水解酶（sbslGUS），研究其酶學特性，并篩選其轉化黃芩苷的條件，以期提高黃芩素收率，為相關高效生產提供新思路。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，配置四元泵、VWD 檢測器、柱溫箱、自動進樣器、工作站（美國Agilent 公司）； KQ-300 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）； FW-200 型高速萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）； SQP 型電子天平［十萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； JY-30002 型電子天平（廣州玉治儀器有限公司）； DZKW-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業世紀儀器有限公司）； Integral-3 型超純水機（成都寶賽思科技有限公司）。

黃芩苷（純度95.4%，批號110715-201821）、黃芩素（純度97.9%，批號111595-201808） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 黃芩苷對照品（純度85%，批號nkl201119038） 購自成都鈉鈳鋰生物科技有限公司。乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）； 甲醇為色譜純（成都市科龍化工試劑廠）；甲酸為色譜純（成都市科龍儀器有限公司）； 其余試劑均為分析純； 水為超純水（超純水機制備）。

黃芩莖葉經四川省中醫藥科學院李青苗研究員鑒定，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的莖葉。

2 方法與結果

2.1 酶活性測定

2.1.1 測定條件 參考文獻［6］ 報道，以黃芩苷為底物。精密量取13.4 mmol/L pH 6.0 的黃芩苷溶液1 mL、0.02 mol/L pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液2 mL、sbslGUS 提取液0.5 mL，在45 ℃、pH 6.0 條件下反應20 min，加入3 倍酶解體系量乙醇終止反應，轉移至50 mL 量瓶中，70%乙醇超聲處理20 min，放置至室溫，70%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，進樣分析，計算酶活性（酶活性定義為在45 ℃、pH 6.0 條件下，每1 h催化酶解1 μmol 黃芩苷所需的酶量為1 U［7-8］，結果以生藥計，單位為U/g）。

2.1.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相0.1% 甲酸（A） -甲醇（B），梯度洗脫（0～8 min，50%B； 8 ～9 min，50% ～70%B； 9 ～20 min，70%B）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長278 nm； 進樣量10 μL。理論塔板數按黃芩苷色譜峰計，應不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、黃芩素對照品適量，70%乙醇制成每1 mL 分別含兩者156.84、177.59 μg 的溶液，即得。

2.1.4 供試品溶液制備 同“2.1.1” 項。

2.1.5 線性關系考察 分別精密移取對照品溶液0.5、1、2、4、5、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%乙醇定容，在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.6 精密度試驗 取同一質量濃度對照品溶液適量，在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為0.14%、1.11%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定，測得黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為0.12%、1.83%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 按“2.1.4” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定，測得黃芩素、黃芩苷含量RSD 分別為1.73%、1.54%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密量取各成分含量已知的供試品溶液6 份，加入適量對照品溶液，混勻，在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，黃芩苷、黃芩素平均加樣回收率分別為99.63%、100.25%，RSD 分別為1.97%、1.92%。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 篩選 參照文獻［6-9］ 報道的方法，并略加改進。將干燥黃芩莖葉粉碎，過40 目篩，稱取3 份，每份50 g，第1 份加24 倍量水，在45 ℃下水浴浸提12 h； 第2 份分別加14、10 倍量水，室溫攪拌提取2 次，每次30 min； 第3 份分別加14、10 倍量磷酸緩沖鹽溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），室溫攪拌提取2 次，每次30 min，8 000 r/min 離心8 min，即得提取液，按“2.1” 項下方法測定酶活性。結果，3 份提取液酶活性分別為460、1 322、1 401 U/g，表明水浴浸提后酶活性最低，而水或磷酸緩沖鹽溶液室溫攪拌提取后較高，結合實際生產應用，最終確定為用水攪拌提取。

2.2.2 正交試驗 在“2.2.1” 項下結果基礎上，選擇粒度（A，10、20、40 目）、加水量（B，8、10、12 倍）、提取時間（C，15、30、45 min）、提取次數（D，1、2、3 次） 作為影響因素，酶活性為評價指標，采用L9（34） 正交試驗表，結果見表2，方差分析見表3。由此可知，各因素影響程度依次為A＞D＞C＞B，最優水平為A3B2C1D3； 因素A有顯著影響（P＜0.05），B、C、D無顯著影響（P＞0.05）。最終確定，最優提取工藝為黃芩莖葉粉碎后過40 目篩，室溫下加10 倍量水（第1 次多加4 倍藥材吸水量） 攪拌提取3 次，每次15 min，8 000 r/min 離心8 min，合并上清液。

表2 正交試驗設計與結果Tab.2 Design and results for orthogonal tests

表3 方差分析結果Tab.3 Results for analysis of variance

按上述優化工藝進行3 批驗證試驗，測得酶活性分別為1 621、1 554、1 610 U/g，平均值為1 595 U/g （RSD＝2.27%），表明該工藝穩定可行，重復性良好。

2.3 酶學性質研究 參考文獻［10-12］ 報道。

2.3.1 底物濃度、動力學常數測定 分別配制2.2、4.3、6.5、8.6、10.8 mmol/L 黃芩苷溶液，按“2.1” 項下方法測定酶活性，考察底物濃度與酶解速度的關系，結果見圖2，再通過Lineweaver-Burk 雙倒數作圖，計算最大反應速率Vmax、米氏常數Km（Km表示酶與底物結合的難易程度，其數值越小，底物與酶的親和力越大），結果見圖3。由此可知，底物濃度與酶解速度的關系符合酶促動力學，擬合方程為Y＝0.000 09X＋0.014 2 （R2＝0.994 2，其中X為1/［S］，Y為1/V），Vmax為70.42 μmol/h，Km為0.006 3 mol/L。

圖2 底物濃度與酶活性的關系Fig.2 Relationship between substrate concentration and enzymatic activity

2.3.2 pH 值對酶活性的影響 使sbslGUS 酶解體系分別處于不同pH 值 （4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0） 環境中，按“2.1” 項下方法測定酶活性，以100%為最高值計算相對酶活性，結果見圖4。由此可知，最適pH 值為6.0，與文獻［13］ 報道接近； 酶活性在pH 值5.54 ～6.55 下較高，并且過高或過低都會影響酶構象，從而影響其與底物的結合能力，導致其活性降低［14］。

圖4 pH 值對酶活性的影響Fig.4 Effect of pH value on enzymatic activity

2.3.3 pH 穩定性研究 將sbslGUS 分別置于不同pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0） 下保持4、8、12、24、36 h 后立即取出，按“2.1” 項下方法測定酶活性，結果見圖5。由此可知，sbslGUS 在pH 4.0～7.0 范圍內穩定性良好，36 h 內相對酶活性均大于85%。

圖5 不同時間點sbslGUS pH 穩定性Fig.5 pH stabilities for sbslGUS at different time points

2.3.4 溫度對酶活性的影響 固定pH 值6.0，在不同溫度 （4、20、30、40、45、50、55、60、70 ℃） 下按 “2.1” 項下方法測定酶活性，以100%為最高值計算相對酶活性，結果見圖6。由此可知，酶活性在4 ～45 ℃下呈緩慢升高的趨勢，以40～60 ℃更明顯，但60 ℃后明顯降低，最終確定為45 ℃。

圖6 溫度對酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on enzymatic activity

2.3.5 熱穩定性研究 將sbslGUS 分別置于不同溫度下保持一定時間（4、30 ℃下保持4、8、12、24、48 h，45、50、60 ℃下保持0.5、1、2、3、4 h），于對應時間點取出，按“2.1” 項下方法測定酶活性，以最初提取的酶活性為100%計算相對酶活性，結果見圖7。由此可知，sbslGUS 在4 ～30 ℃下熱穩定性較高，45 ℃下逐漸降低，50 ℃以上后明顯降低。

圖7 不同溫度sbslGUS 熱穩定性Fig.7 Thermal stabilities for sbslGUS at different temperatures

2.3.6 金屬離子對酶活性的影響 將sbslGUS 分別與不同濃度（10、50、100 mmol/L） 金屬離子（Na＋、K＋、Cu2＋、Mg2＋、Ca2＋） 等體積混合后，室溫靜置1 h，按“2.1” 項下方法測定酶活性，以同等條件下sbslGUS 與等體積去離子水混合后的酶活性為100%計算相對酶活性，結果見圖8。由此可知，Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋對酶活性影響不大，而Cu2＋能激活酶活性，并且作用隨著其濃度升高而增強，在100 mmol/L 時提高了約300%。

圖8 金屬離子對酶活性的影響Fig.8 Effect of metal ion on enzymatic activity

2.4 實際應用研究 參考文獻［15-17］ 報道，用sbslGUS 酶解黃芩苷以制備黃芩素。

2.4.1 供試品溶液制備 精密量取268.8 mmol/L黃芩苷溶液1 mL，加入適量sbslGUS 提取液，磷酸緩沖鹽溶液補充至4 mL，在上述條件下酶解反應一定時間，加入3 倍酶解體系量乙醇終止反應，轉移至50 mL 量瓶中，加70%乙醇超聲處理20 min，放置至室溫，70% 乙醇定容至刻度，精密量取1 mL，置于50 mL 量瓶中，70%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。然后，在“2.1.2” 項色譜條件下進樣測定，計算黃芩苷酶解轉化率，公式為轉化率＝ ［m2×M1/（m1×M2）］×100%，其中m1為黃芩苷實際投入量，m2為黃芩素實際測得量，M1為黃芩苷相對分子質量，M2為黃芩素相對分子質量。

2.4.2 pH 值對轉化率的影響 精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液、sbslGUS 提取液各1 mL，加入不同pH 值的磷酸緩沖鹽溶液2 mL，使酶解體系pH 值分別為5.0、5.5、5.8、6.0、6.5，反應12 h，按“2.4.1” 項下方法測定轉化率，結果分別為20.61%、71.86%、95.19%、95.25%、90.68%，最終確定為6.0。

2.4.3 溫度對轉化率的影響 精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液、sbslGUS 提取液各1 mL，加入pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液2 mL，分別在30、40、45、50、55 ℃下反應12 h，按“2.4.1” 項下方法測定轉化率，結果分別為83.03%、89.33%、97.25%、48.14%、34.02%，最終確定為45 ℃。

2.4.4 反應時間對轉化率的影響 精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液、sbslGUS 提取液各1 mL，加入pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液2 mL，置于45 ℃水浴鍋中，分別酶解2、4、8、10、12、24 h，按“2.4.1” 項下方法測定轉化率，結果分別 為 33.73%、55.32%、90.58%、94.03%、98.01%、98.19%，最終確定為12 h 以上。

2.4.5 底物初始濃度對轉化率的影響 黃芩苷與sbslGUS 提取液按0.269 mmol/1 mL 比例，加入pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液，制成黃芩苷濃度分別為22.4、44.8、67.2、89.6、112 mmol/L 的溶液，置于45 ℃水浴鍋中酶解12 h，按“2.4.1” 項下方法測定轉化率，結果分別為97.75%、98.26%、97.95%、95.68%、78.37%，符合酶促反應的中間絡合物學說，為了提高生產效率和黃芩苷轉化率，最終確定為67.2 mmol/L。

2.4.6 加酶量對轉化率的影響 參考文獻［8］報道，精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液1 mL，分別加入sbslGUS 提取液0.25、0.5、1、1.25、1.5 mL，pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液補足至4 mL，45 ℃水浴酶解12 h，按“2.4.1” 項下方法測定轉化率，結果分別為30.37%、60.34%、95.67%、96.19%、96.53%，表明加酶量達到1 mL 時酶含量已經趨飽和，最終確定為1 mL/0.269 mmol 黃芩苷。

2.4.7 驗證試驗 根據“2.4.2” 至“2.4.6” 項下結果，得到最優制備工藝為pH 值6.0，溫度45 ℃，反應時間12 h 以上，底物初始濃度67.2 mmol/L，加酶量1 mL/0.269 mmol 黃芩苷。按上述優化工藝進行3 批驗證試驗，測得轉化率分別為97.50%、98.12%、97.86%，平均值為97.83%。

3 討論

3.1sbslGUS 提取工藝 本實驗首先采用文獻［18］ 報道的45 ℃浸泡提取黃芩糖苷酶，發現提取液酶活性遠低于室溫攪拌提取所得，并且水提取、緩沖鹽提取酶液活性差異不大，故采用實際生產中更方便的加水攪拌提取。在篩選sbslGUS 提取條件的單因素、正交試驗中發現，黃芩莖葉不同粉碎粒度對提取液酶活性有顯著影響，40 目明顯優于20 目； 黃芩莖葉酶水提時間15 min 優于30 min，推測可能是因為sbslGUS 被快速提取后與水液中某種物質（底物） 發生作用，從而時間延長，酶活性降低。

3.2sbslGUS 酶學性質 目前，轉化黃芩苷生成黃芩素的糖苷酶主要通過真菌培養、基因克隆等［13，19］，尚未發現黃芩莖葉中葡萄糖醛酸水解酶制備的報道。本實驗發現，sbslGUS 以黃芩苷為底物時，最適酶活條件為pH 值6.0，溫度45 ℃，酶解符合酶促反應動力學，Km為0.006 3 mol/L，Vmax為 70.42 μmol/h。另外，Na＋、K＋、Mg2＋、Ca2＋對sbslGUS 酶活性影響不大，而Cu2＋對其有很強的激活作用，但它會使黃芩苷酶解轉化率顯著降低，推測可能是因為黃芩苷等黃酮類化合物與金屬離子螯合形成配合物，從而阻礙酶解反應［15，20］。

3.3sbslGUS 實際應用 本實驗以黃芩苷酶解轉化率為評價指標，對sbslGUS 酶解pH、溫度、反應時間、底物濃度、加酶量等進行考察，確定最佳反應條件為黃芩苷初始濃度67.2 mmol/L，pH 值6.0，溫度45 ℃，sbslGUS 提取液加入量1 mL/0.269 mmol 黃芩苷，反應時間不少于12 h，黃芩素產率達95%以上，可為黃芩苷類結構轉化和從天然植物中酶解提取生理活性更強的苷元類成分提供參考。