UPLC 法同時(shí)測(cè)定護(hù)肝片中8 種五味子木脂素的含量

趙志遠(yuǎn)，張金朋，趙 碩，劉媛媛

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 藥學(xué)院，山東 泰安 271016］

護(hù)肝片收載于2020 年版 《中國(guó)藥典》 一部［1］，由柴胡、五味子、板藍(lán)根等多味中藥組成［2］，主要用于治療各種原因?qū)е碌母喂δ苁軗p，方中五味子是其發(fā)揮養(yǎng)肝作用的主要藥味，物質(zhì)基礎(chǔ)是木脂素類(lèi)化合物，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)具有抗癲癇［3］、提高學(xué)習(xí)記憶能力［4］、鎮(zhèn)靜催眠［5］功能，對(duì)于消化系統(tǒng)具有保肝護(hù)膽［6］功效，此外還有著抗腫瘤［7］、延緩衰老［8］、抗病毒［9］、抗炎、免疫調(diào)節(jié)［10］作用。

現(xiàn)行藥典中護(hù)肝片“含量測(cè)定” 項(xiàng)下以五味子醇甲為評(píng)價(jià)指標(biāo)，而同一類(lèi)化合物藥理作用相似，臨床使用時(shí)容易產(chǎn)生疊加效應(yīng)［11-12］。目前，木脂素含量測(cè)定方法主要包括HPLC 法、UPLC法、LC-MS 法等［13］，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC 法，與HPLC 法相比分離效率更高，耗時(shí)更短［14］，更適合中藥復(fù)雜成分的分離［15］，在提高效率的前提下，同時(shí)測(cè)定五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制、臨床用藥等效性研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Nexera X2 型超高效液相色譜儀，配置LC-30AD 型溶液輸送單元、SIL-30AC 型高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M30A 型光電二極管陣列紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、CTO-20AC 型柱溫箱（日本島津公司）； Direct-Q?8UV-R 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 公司）； ES-E120A 型電子分析天平（天津德安特傳感技術(shù)有限公司）； KQ-600DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Fresco21 型高速冷凍離心機(jī) ［賽默飛世爾科技 （中國(guó)） 有限公司］。

1.2 試劑與藥物 五味子醇甲（批號(hào)D1827017，純度≥98.00%）、五味子醇乙（批號(hào)F1508140，純度≥98.00%）、五味子甲素（批號(hào)D1911039，純度≥98.00%）、五味子丙素（批號(hào)D1608128，純度≥98.00%） 對(duì)照品均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 戈米辛J （批號(hào)G99633663，純度≥98.00%）、當(dāng)歸酰戈米辛 H （ 批號(hào)A43133661，純度≥98.00%） 對(duì)照品均購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司； 當(dāng)歸酰戈米辛Q 對(duì)照品（批號(hào)PCS-210329，純度≥98.00%） 購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司； 五味子酚對(duì)照品（批號(hào)C12256480，純度≥98.00%） 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。護(hù)肝片 （批號(hào)202106114、202111015、202105212，糖衣片，片心重0.35 g）購(gòu)自黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司。甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為純化水（由Direct-Q?8UV-R 型超純水系統(tǒng)制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WELCH Ultimate ?-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）； 流動(dòng)相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～0.01 min，45%B； 0.01 ～1.2 min，45% ～53% B； 1.2 ～3 min，53% ～53.5% B； 3 ～10 min，53.5% ～55% B； 10 ～13 min，55% ～95%B； 13 ～15 min，95%B； 15 ～17 min，95% ～45%B； 17 ～21 min，45% B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm； 進(jìn)樣量6 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取對(duì)照品五味子醇甲5 mg、五味子醇乙和五味子甲素各1.5 mg、當(dāng)歸酰戈米辛Q 和五味子丙素各0.5 mg、五味子酚0.2 mg、戈米辛J 0.3 mg、當(dāng)歸酰戈米辛H 1 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為五味子醇甲500 μg/mL、戈米辛J 30 μg/mL、五味子醇乙150 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛Q 50 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛H 100 μg/mL、五味子酚20 μg/mL、五味子甲素150 μg/mL、五味子丙素50 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 取本品3 片，除去包衣，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.4 g，加入乙酸乙酯16 mL，超聲（功率600 W，溫度30 ℃） 提取30 min，放冷，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，在蒸發(fā)皿上75 ℃水浴蒸干，10 mL 甲醇超聲溶解，反復(fù)清洗蒸發(fā)皿，搖勻，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品、供試品溶液及空白溶劑（甲醇） 適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣6 μL 測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形較好，均能達(dá)到基線分離（分離度均大于1.5），理論塔板數(shù)均不低于8 000，空白溶劑無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 分別取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2.5、1、0.71、0.5、0.05 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得稀釋0、2、5、7、10、100 倍的線性工作液，取適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4” 項(xiàng)下稀釋2 倍的線性工作液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素峰面積RSD 分別為0.28%、0.49%、0.31%、0.30%、0.39%、0.62%、1.04%、1.04%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)202106114） 適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素峰面積RSD 分別為0.51%、0.80%、0.48%、0.53%、1.27%、1.26%、0.35%、1.19%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取本品 （批號(hào)202106114） 粉末6 份，每份0.4 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素峰面積RSD 分別為0.63%、1.05%、0.65%、0.36%、0.73%、0.90%、1.41%、1.30%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取本品 （批號(hào)202106114） 粉末0.2 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分原有量分別為五味子醇甲23.24 μg、戈米辛J 2.63 μg、五味子醇乙5.85 μg、當(dāng)歸酰戈米辛H 3.95 μg、當(dāng)歸酰戈米辛Q 1.15 μg、五味子酚1.04 μg、五味子甲素9.82 μg、五味子丙素2.60 μg。精密量取上述供試品溶液9 份，每份1 mL，置于9 個(gè)5 mL 量瓶中，分別按50%、100%、150%水平加入對(duì)照品溶液各10 mL，平行3 份，分別取1 mL，置于9 個(gè)5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素平均加樣回收率分別為101.94%、97.56%、102.67%、101.58%、99.14%、96.84%、98.07%、96.02%，RSD 分別為0.62%、1.30%、1.45%、0.86%、0.76%、1.28%、1.14%、1.60%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品（批號(hào)202106114、202111015、202105212，編號(hào)1 ～3） 粉末，每批0.4 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下平行制備3 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分含量由高到低依次為五味子醇甲、五味子甲素、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子丙素、戈米辛J、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚。在中藥質(zhì)量控制評(píng)價(jià)模式中，五味子醇甲作為五味子糖漿質(zhì)量控制指標(biāo)，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 標(biāo)準(zhǔn)（RSD＜2%）。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.2 Results for content determination of various constituents （μg/g，n＝3）

3 討論

3.1 提取方法選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了80% 甲醇［16］、甲醇［17］超聲提取10、20、30 min，發(fā)現(xiàn)色譜圖中雜質(zhì)峰太多，無(wú)法對(duì)五味子木脂素進(jìn)行定量分析。綜合提取率等多種指標(biāo)，最終確定乙酸乙酯超聲提取30 min，揮干后甲醇溶解作為提取方法。

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道，分別考察了WELCH Ultimate?-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC ? BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 色譜柱，發(fā)現(xiàn)各五味子木脂素在WELCH Ultimate?-C18色譜柱上色譜峰峰形、分離度均良好。再考察了流動(dòng)相甲醇-水，發(fā)現(xiàn)各五味子木脂素出峰不完全，分離度不符合要求，而改用乙腈-水洗脫后出峰良好。然后，分別考察了0.1% 甲酸、0.1% 乙酸、0.1% 磷酸，發(fā)現(xiàn)加入0.1%甲酸后各五味子木脂素分離度良好，峰形對(duì)稱(chēng)。

前期報(bào)道，木脂素檢測(cè)波長(zhǎng)主要包括220 nm［19］、250 nm［20］、254 nm［21］。本實(shí)驗(yàn)在200 ～400 nm 波長(zhǎng)處對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)各五味子木脂素在267 nm 處基線平穩(wěn)，吸收最好，雜質(zhì)峰最少。再分別考察了柱溫（35、40、45 ℃）、體積流量 （0.28、0.3、0.32 mL/min）、進(jìn)樣量（4、6、8 μL），發(fā)現(xiàn)在柱溫40 ℃、體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量6 μL 下各五味子木脂素色譜峰峰形理想，可與周?chē)蓴_物質(zhì)達(dá)到良好的分離效果。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC 法同時(shí)測(cè)定護(hù)肝片中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素的含量，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，而且專(zhuān)屬性強(qiáng)，精密度好，可為后續(xù)該制劑及其所含木脂素類(lèi)化合物的研究奠定基礎(chǔ)。