基于網絡藥理學的犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜“異病同治”研究

溫國揚 ，羅文

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510000

川崎病是由感染因素引發的急性全身免疫性血管炎，其嚴重并發癥為冠狀動脈病變，尤其好發于5歲以下兒童，而川崎病引起的冠狀動脈病變已成為部分國家和地區常見的后天性心臟病之一[1]，其發病率呈增高趨勢[2-3]。過敏性紫癜也稱IgA血管炎，是一種發生在兒童時期的系統性血管炎，其機制與免疫紊亂相關，以四肢對稱性出血性皮疹為特征，常伴關節、消化道及腎臟等多系統器官損害[4]。兩種疾病嚴重影響兒童的健康。目前川崎病和過敏性紫癜治療尚缺乏針對性、統一性，尚無特效方法。

中醫學認為，川崎病由小兒正氣不足、邪氣內伏引起，治療上以溫病衛氣營血理論進行指導論治，治以清熱、涼血等[5-6]。兒童過敏性紫癜病機為伏邪潛內、外因觸發，應驅除邪氣，治以清火解毒、化瘀通絡[7]。血管炎發病由“伏火”引起，治以清火、降火、散瘀、化瘀等[8]。犀角地黃湯具有清熱涼血散瘀的功效，用于各種出血、斑疹等免疫性血管炎如過敏性紫癜、川崎病等。本研究采用網絡藥理學方法探討犀角地黃湯“異病同治”川崎病和過敏性紫癜的分子機制，為后續相關研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 犀角地黃湯靶點收集

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[9]（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，檢索牡丹皮、赤芍的活性成分，借助Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）轉化為所對應的靶點名稱；生地黃、水牛角的活性成分根據已發表的文獻[10-12]收集，從PubChem 數據庫[13]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取化學結構，通過Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）進行活性成分 篩 選 ， 使 用 SwissTargetPrediction （http://swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測，得到犀角地黃湯活性成分及其作用靶點。

1.2 川崎病和過敏性紫癜靶點收集

通過GeneCards[14]（http://swisstargetprediction.ch/）、DrugBank[15]（https://go.drugbank.com/） 和OMIM[16]數據庫（https://www.omim.org/）， 以“kawasaki disease” “Henoch-Schonlein purpura”“anaphylactoid purpura”“IgA vasculitis”為檢索詞檢索疾病靶點，篩選得出基因靶點。

1.3 犀角地黃湯活性成分-川崎病和過敏性紫癜靶點蛋白相互作用網絡構建

通過Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲取藥物活性成分作用靶點和疾病靶點的交集靶點，并構建韋恩圖，交集靶點通過STRING平臺[17]（https://cn.string-db.org）構建蛋白相互作用（PPI）網絡，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設定為＞0.9，得到PPI網絡。將PPI網絡信息導入Cytoscape3.7.2 軟件中的MCODE 插件，對PPI 網絡進一步分析，得到核心蛋白質功能模塊，并對其分析總結。

1.4 靶點富集分析

將交集靶點錄入Metascape 數據庫[18]（http://metascape.org/gp/），將生物種類設定為“Homo sapiens”，分析方法選擇“Custom Analysis”進行富集分析，如生物過程、細胞組分、分子功能及信號通路，總結與藥物、疾病相關的核心分析結果，將數據通過微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化展示。

1.5 活性成分-交集靶點-通路網絡構建

將活性成分、交集靶點、通路共同建立網絡數據庫，導入Cytoscape3.7.2軟件構建活性成分-交集靶點-通路網絡，利用Network Analyzer對網絡進行分析，根據網絡連接度、介度、緊密度綜合分析網絡核心成分、主要靶點及核心通路。

1.6 分子對接驗證

將活性成分-交集靶點網絡中節點度值排名較前的核心靶點通過PDB 數據庫[19]采集其結構然后利用PyMOL進行去水分子、去配體處理，AutoDock Tool進行加氫等處理，得到受體結構。網絡中節點度值排名較前的活性成分結構通過PubChem 數據庫收集，AutoDock Tool處理活性成分結構，得到配體。隨后利用Autodock Tool實現分子對接，并將對接結果可視化及記錄對接能量。

2 結果

2.1 犀角地黃湯活性成分及成分靶點預測結果

通過TCMSP平臺將篩選條件定為OB≥30%，DL≥0.18，檢索牡丹皮、赤芍的活性成分，通過已發表的文獻搜索生地黃、水牛角的活性成分，經篩選后收集到相應成分共19個，其中牡丹皮5個、赤芍10個、生地黃2個、水牛角2個，有3個為共有活性成分，見表1。

表1 犀角地黃湯主要活性成分

經活性成分配對靶點，其中牡丹皮靶點226個、赤芍靶點147個、生地黃靶點34個、水牛角靶點136個，經去除重復值，共獲取306個靶點基因。

2.2 川崎病和過敏性紫癜靶點結果

通過GeneCards、DrugBank、OMIM數據庫篩選去除重復值，獲得川崎病潛在靶點1 416個，過敏性紫癜靶點1 093個。

2.3 蛋白相互作用網絡構建

將篩選的犀角地黃湯活性成分靶點與川崎病和過敏性紫癜疾病靶點通過Venny2.1.0取交集靶點，并構建韋恩圖，得到犀角地黃湯活性成分-川崎病和過敏性紫癜共同靶點71個，見圖1。將交集靶點導入STRING數據庫，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設定為＞0.9，得到PPI網絡，見圖2。其中核心靶點共66 個，網絡平均連接度為7.333，介度0.023，緊密度0.431。

圖1 犀角地黃湯活性成分-川崎病-過敏性紫癜交集靶點韋恩圖

圖2 犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜靶點PPI網絡

得到PPI 網絡后，運用Cytoscape3.7.2 中的MCODE插件，通過分子復合物檢測算法對相互作用關系進行分析，根據P值，保留PPI網絡與模塊中3個最佳評分的生物學進程對其進行功能描述，其中主要生物學功能為細胞因子受體結合，見表2。

表2 犀角地黃湯-川崎病-過敏性紫癜靶點PPI網絡功能描述

2.4 GO和KEGG通路富集分析結果

借助Metascape 數據庫對71 個交集靶點進行富集分析，GO 和KEGG 通路富集分析結果見圖3。

圖3 犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜靶點富集分析

由結果可見，多個靶點的功能與川崎病和過敏性紫癜的發生密不可分。犀角地黃湯參與的生物學過程（BP） 有1 365 條，包括對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、對細菌來源分子的反應（response to molecule of bacterial origin）、炎癥反應（inflammatory response）。細胞組分（CC）有51 條，分子功能（MF）有86 條。參與信號通路共161條，包括血管病變通路如流體剪切力；炎癥通路如TNF信號通路、IL-17信號通路、趨化因子信號通路；補體和凝血級聯反應等。相關靶點調節川崎病和過敏性紫癜的功能主要富集于細胞因子相關活性、細胞信號傳遞功能，受體配體活性等。

2.5 活性成分-交集靶點-通路網絡構建結果

運用Cytoscape3.7.2構建犀角地黃湯活性成分-交集靶點-通路網絡，節點106個，連接線525條，見圖4。活性成分-交集靶點-通路網絡分析結果：槲皮素連接度為60，介度為0.349 3，緊密度為0.633 5，預測槲皮素為犀角地黃湯治療療川崎病和過敏性紫癜的主要成分，其次為山柰酚（連接度為23，介度為0.048 9，緊密度為0.430 4）、黃芩素（連接度為13，介度為0.010 3，緊密度為0.396 9）。IL6在網絡中的連接度為18，介度為0.037 6，緊密度為0.505 0，AKT1在網絡中的連接度為18，介度為0.024 9，緊密度為0.500 0，預測IL6、AKT1為犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜的主要靶點。根據2種疾病發病機制為炎癥及免疫反應，病理變化為血管內皮損傷，TNF信號通路在網絡中的連接度為20，介度為0.015 6，緊密度為0.423 2，流體剪切力在網絡中的連接度為25，介度為0.034 9，緊密度為0.434 0，推斷TNF信號通路及流體剪切力為核心信號通路。

圖4 犀角地黃湯治療川崎病和過敏性紫癜活性成分-交集靶點-通路網絡

2.6 分子對接驗證

根據活性成分-交集靶點-通路網絡分析結果，槲皮素、山柰酚、黃芩素等為主要活性成分，IL6、AKT1等為核心靶點，通過分子對接，可得出槲皮素、山柰酚、黃芩素與IL6對接能量分別為-6.4、-6.3、-6.6 kcal/mol，槲皮素、山柰酚、黃芩素與AKT1 對接能量為-9.2、-9.2、-9.4 kcal/mol，說明活性成分與核心靶點結合活性較好，見表3，將對接能量以熱圖形式展示（見圖5）。將槲皮素等配體與AKT1對接得到結構圖，見圖6。圖中可以清晰顯示氫鍵連接緊密。

圖5 犀角地黃湯主要活性成分與核心靶點分子對接熱圖

圖6 犀角地黃湯主要活性成分與AKT1對接模式

表3 犀角地黃湯主要活性成分與核心靶點分子對接結果（kcal/mol）

3 討論

川崎病和過敏性紫癜均是與免疫反應相關的血管炎，可導致動脈瘤形成和腎臟損傷等[20]。研究表明，炎癥介質、靶向黏膜屏障功能及IgA沉積引起的血管內皮因子病變與血管炎發生有關[21-24]。其治療藥物多為激素、免疫球蛋白等，可調節免疫、延緩疾病進展、降低復發率，但長期用藥可能出現耐藥，且存在藥物不良反應，可能增加感染及腫瘤風險。

中醫藥治川崎病和過敏性紫癜均具有顯著療效。葉國華等[25]發現，犀角地黃湯可改善患者凝血指標和炎癥反應，降低患者出血傾向。宋珂等[26-27]發現，犀角地黃湯可有效減輕過敏性紫癜患者臨床癥狀及降低腎損傷的比例。劉旭和等[28]發現，犀角地黃湯加味可有效降低過敏性紫癜患兒復發率。基礎研究表明，犀角地黃湯可減少促炎因子分泌、抑制炎癥反應[29-30]。

根據網絡藥理學及分子對接結果可知，槲皮素、山柰酚、黃芩素是犀角地黃湯的主要活性成分，核心靶點主要是IL6、AKT1，信號通路主要有TNF信號通路、流體剪切力。川崎病及過敏性紫癜發病時會激活免疫細胞，產生多種細胞因子如IL6，而IL6又為核因子（NF）-κB靶點，可誘導其過度活化，進而產生多種炎癥因子[31]，而TNF信號通路激活又會釋放NF-κB，與IL6結合引發炎癥反應，出現關節痛、紅腫、腎損害等。AKT1激活增強血管內皮因子誘導的內皮屏障破壞[32]。同時，TNF信號通路激活產生炎癥因子損傷血管內皮，從而發生血管炎。研究發現，流體剪切力是維持血管穩態的重要因素，流體剪切力譜改變是多種血管疾病的病理特征[33]，其機制是流體剪切力可抑制炎癥介質對內皮細胞Smad2/3 的激活和EndMT 反應[34]，而2種疾病均可產生大量炎癥介質，可破壞流體剪切力譜，從而產生血管病變，臨床表現為紫癜、紅斑等。槲皮素可抑制炎癥小體分泌[35]，并可改變炎癥代謝產物平衡、減輕炎癥，克服炎癥對血管內皮的有害影響[36]。山柰酚可起到保護血管免受氧化應激和炎癥引起的損傷的作用[37]。黃芩素可預防血管的氧化應激和炎癥損傷[38]。因此，犀角地黃湯可能通過減少IL6、AKT1生成及分泌，抑制TNF信號通路產生炎癥因子，減輕內皮損傷，保護流體剪切力譜，防止血管病變，發揮治療作用。

本研究基于網絡藥理學方法展示犀角地黃湯“異病同治”川崎病和過敏性紫癜內在機制，闡釋犀角地黃湯具有保護血管內皮、抗炎、調節免疫等作用，進一步探究中藥治療這2種疾病的生物學功能及作用通路。