基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討芩薊涼血合劑治療便秘作用機制

李鵬，金文琪，李小嘉，胡婕，朱影，郭修田

上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071

便秘是全球常見問題，歐美國家成人功能性便秘患病率為7.9%～8.6%[1]。主要包括排便次數(shù)減少、排便不盡、排便時間延長、便質(zhì)干結(jié)等癥狀[2-3]。便秘和年齡、飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，隨著年齡增長，不僅患病率逐漸增加，患者焦慮心理也逐步加重。便秘分為原發(fā)性與繼發(fā)性，原發(fā)性便秘包括便秘型腸易激綜合征、功能性便秘、慢傳輸便秘及肌肉或神經(jīng)損傷引起的排便障礙，繼發(fā)性便秘可能由代謝紊亂（如高鈣血癥）、藥物（如阿片類藥物）、原發(fā)性結(jié)腸疾?。ㄈ缃Y(jié)腸癌、直腸炎）和神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致[4-5]。目前，便秘有藥物、非藥物等療法，但藥物依賴性強、遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率較高[6]。

芩薊涼血合劑是上海市中醫(yī)醫(yī)院臨床應(yīng)用近30年的成藥復(fù)方，包括熟地黃、大薊、黃芩、火麻仁、茜草、地榆、槐角、側(cè)柏葉、仙鶴草、甘草，共奏清熱涼血、潤腸通便之功，臨證發(fā)現(xiàn)其不僅可改善早期急性痔出血，還可減少排便時間，緩解便質(zhì)干結(jié)、排便不盡等癥狀[7]。該方治療便秘療效顯著，但作用機制尚未闡明，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索芩薊涼血合劑治療便秘的活性成分、核心靶點及作用機制，以期為芩薊涼血合劑治療便秘提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 芩薊涼血合劑活性成分及靶點篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18進行篩選，獲取黃芩、火麻仁、熟地黃、側(cè)柏葉、大薊、地榆、茜草、槐角、仙鶴草、甘草的活性成分及靶點，并在UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中明確靶蛋白對應(yīng)的基因名稱與ID。

1.2 便秘潛在靶點篩選

采用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/about）、TTD數(shù)據(jù)庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp）及DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/），以“Constipation”為關(guān)鍵詞，以“gene”與“homo sapiens”為限制條件檢索便秘相關(guān)疾病靶點，并挖掘DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）涉及的疾病靶點為補充，刪除重復(fù)靶點后建立便秘的疾病靶點庫。

1.3 芩薊涼血合劑-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用BioVenn在線作圖軟件工具平臺（http://www.biovenn.nl/）制作芩薊涼血合劑活性成分靶點與疾病交集靶點韋恩圖，獲取的交集靶點即芩薊涼血合劑治療便秘的潛在作用靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點篩選

將“1.3”中獲取的交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org），選擇“Homo sapiens”，最小相互作用閾值（minimum required interaction score）為0.9，隱藏游離節(jié)點，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)并下載.tsv格式文件，將以上數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.1軟件，利用CytoNCA插件進行數(shù)據(jù)分析，計算出節(jié)點的中介中心性（BC）、接近中心性、度中心性（DC）及特征向量中心性（EC）。最后，按照上述4類數(shù)值均大于中位數(shù)篩選，得出核心靶點。將Network及Type數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.1軟件構(gòu)建芩薊涼血合劑治療便秘中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，分析節(jié)點連接度、介度等。采用CytoHubba插件對中藥-活性成分-便秘靶點網(wǎng)絡(luò)進行度值計算，選取排名前5位的關(guān)鍵成分。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

以P＜0.01 為限定條件，利用Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org）對核心靶點進行GO 功能與KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包括細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）及生物過程（BP）。采用KEGG富集分析獲取芩薊涼血合劑與便秘的共同靶點所富集的信號通路，并以條形圖展示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 芩薊涼血合劑活性成分篩選結(jié)果

全方共篩選得出活性成分134個，其中側(cè)柏葉7個、大薊7個、地榆9個、茜草13個、槐角6個、仙鶴草5個、火麻仁6個、熟地黃2個、黃芩12個、甘草88個，靶點共289個。

2.2 便秘潛在靶點收集

通過數(shù)據(jù)庫檢索并刪除重復(fù)基因后，共得到857個便秘靶點（見圖1），芩薊涼血合劑與便秘交集靶點共216個（見圖2）。

圖1 綜合數(shù)據(jù)庫便秘靶點韋恩圖

圖2 芩薊涼血合劑與便秘交集靶點韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將216個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3），代表相互作用的邊共823條。

圖3 芩薊涼血合劑治療便秘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點篩選結(jié)果

最終得出55個核心靶點（見圖4），排名前10位的關(guān)鍵基因為：HSP90AA1、STAT3、MAPK3、TP53、AKT1、MAPK1、RELA、TNF、FOS、IL6。

圖4 芩薊涼血合劑治療便秘核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 核心靶點篩選結(jié)果

采用Cytoscape構(gòu)建芩薊涼血合劑治療便秘-靶點網(wǎng)絡(luò)。圖中共360個節(jié)點、3 167條邊（見圖5）。A1為側(cè)柏葉、大薊共有成分，B1為側(cè)柏葉、地榆、茜草共有成分，C1、C2為側(cè)柏葉、地榆、甘草、槐角、仙鶴草共有成分，D1為大薊、甘草、火麻仁、茜草共有成分，D2為大薊、火麻仁、熟地黃共有成分，E1為地榆、甘草共有成分，E2為地榆、茜草共有成分，F(xiàn)1為槐角、黃芩共有成分，G1為火麻仁、仙鶴草共有成分。CytoHubba插件分析后得出度值排名前5位關(guān)鍵成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇及豆甾醇。

圖5 芩薊涼血合劑治療便秘中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

對216個交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，分別選取前10位MF、CC、BP條目繪制條形圖。MF包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體活動、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白激酶活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)因子活性及MAP激酶活性；CC包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合體、膜閥、囊腔、轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合體、質(zhì)膜蛋白復(fù)合體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合體、髓鞘、紡錘體、血小板α顆粒內(nèi)腔及細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域；BP包括細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、腺體發(fā)育、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、對上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控、對細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、對輻射的反應(yīng)、對縮氨酸的調(diào)控及對miRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。KEGG通路富集分析主要富集在癌癥的途徑、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、化學(xué)致癌-受體激活、甲狀腺激素、HIF-1信號通路、PD-L1在腫瘤中的表達(dá)與PD-1檢查點通路、鉑類藥物耐藥性、JAK-STAT信號通路及甲狀腺癌（見圖6）。

圖6 芩薊涼血合劑治療便秘靶點GO功能和KEGG通路富集分析

3 討論

治療便秘的西藥如滲透性瀉藥、分泌性瀉藥及糞便膨化劑等，存在不良反應(yīng)較多[8]，長期應(yīng)用后腸道敏感性降低，對藥物耐受性增加，導(dǎo)致藥效變差，嚴(yán)重者最終只能選擇手術(shù)治療。芩薊涼血合劑不僅可改善早期急性痔瘡出血，還可改善糞質(zhì)干結(jié)的癥狀，有效緩解便秘，但相關(guān)機制仍未明確[9]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索芩薊涼血合劑治療便秘的作用機制，為后續(xù)芩薊涼血合劑的基礎(chǔ)實驗提供基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，芩薊涼血合劑關(guān)鍵成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等。槲皮素、山柰酚和木犀草素是常見的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎等藥理作用[10]。槲皮素是一種常見的天然黃酮類化合物，通常以糖基化形式存在，可影響多種生理過程及疾病的發(fā)生發(fā)展，包括血壓、免疫功能、神經(jīng)功能、癌癥、衰老等[11-12]。槲皮素在劑量為25 mg/kg、50 mg/kg時可增加腸道推進率、胃泌素、胃動素及P物質(zhì)水平，改善胃腸蠕動，并可通過增加腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物水平，如c-kit、干細(xì)胞因子SCF、水通道蛋白3（AQP3），緩解由洛哌丁胺導(dǎo)致的便秘[13]。在胃腸道中，槲皮素不僅可穩(wěn)定肥大細(xì)胞，抑制組胺及其他化學(xué)物質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)小鼠回腸、結(jié)腸的鈣氯通道活性，以劑量依賴性的方式激活氯離子轉(zhuǎn)運，促進大鼠腸內(nèi)液體分泌，從而改善便秘[14-15]。槲皮素可通過調(diào)控mACHRs信號通路改善由洛哌丁胺誘導(dǎo)的大鼠便秘模型，增加大鼠胃腸道運動及黏蛋白分泌，表明槲皮素治療便秘有效[16]。山柰酚可通過抑制Toll 樣受體4（TLR4）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）和核因子-κB（NF-κB）的激活，減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RIMVECs）炎癥介質(zhì)釋放，包括腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）[17]。還可改善豬腸上皮細(xì)胞的氧化損傷和凋亡，減輕敵草快誘導(dǎo)的氧化損傷和腸屏障功能障礙，表明攝入富含山柰酚的藥物及食物可能改善腸上皮細(xì)胞完整性和功能[18]。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶和p38，與炎癥介質(zhì)的表達(dá)和氧化損傷密切相關(guān)，山柰酚可抑制人單核細(xì)胞系THP-1中脂多糖誘導(dǎo)的MAPK通路表達(dá)[19-20]。木犀草素是一種天然類黃酮，在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞（人上皮細(xì)胞系）中抑制Janus激酶（JAK）/STAT通路，減緩炎癥[21]。β-谷甾醇不僅可降低膽固醇，還具有抗炎、抗血管生成、免疫調(diào)節(jié)及化學(xué)預(yù)防等活性，可能對腸道疾病發(fā)揮作用。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，芩薊涼血合劑治療便秘的核心靶點為HSP90AA1、STAT3、MAPK3、TP53、AKT1 等。HSP90AA1 基因編碼的熱休克蛋白90α（HSP90α）是分子伴侶蛋白HSP90應(yīng)激誘導(dǎo)亞型。細(xì)胞應(yīng)激時，HSP90α水平升高，組織特異性表達(dá)水平各異，在多種癌癥中上調(diào)，與疾病預(yù)后相關(guān)[22]。STAT是JAK的重要底物，JAK/STAT信號通路與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)[23]。腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞是腸道毛細(xì)血管的主要組成部分，是炎癥過程中最重要的分泌和免疫細(xì)胞之一。MAPK是一組可被多種細(xì)胞外刺激物激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)等。MAPK1和MAPK3在MAPK信號通路中起關(guān)鍵作用，抑制MAPK通路可增加腸道水分、促進腸道蠕動，從而改善便秘[24]。TP53是抑癌基因，可抑制細(xì)胞分裂、增殖過快或防止突變以維持細(xì)胞穩(wěn)定性，抑制癌癥的發(fā)生。Vacante等[25]研究表明，便秘可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)或代謝物異常，導(dǎo)致腸道微環(huán)境異常引起的免疫異常、基因突變或缺失，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞自噬持續(xù)缺失可能是便秘病理生理學(xué)的體現(xiàn)。AKT是PI3K/AKT/mTOR信號通路的樞紐，PI3K被生長因子與其同源受體結(jié)合而激活，被激活的PI3K 磷酸化后激活A(yù)KT，進一步通過TSC1/2復(fù)合物激活下游分子mTOR從而阻斷結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞自噬，改善便秘[26]。因此，芩薊涼血合劑可能通過槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等活性成分作用于JAK/STAT、MAPK等信號通路，從而改善腸道功能、緩解便秘。

綜上所述，基于芩薊涼血合劑治療便秘的臨床有效性，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對芩薊涼血合劑治療便秘的關(guān)鍵成分、關(guān)鍵靶點及通路進行預(yù)測與分析，體現(xiàn)芩薊涼血合劑通過多靶點、多通路治療便秘的作用特點，為臨床治療便秘提供依據(jù)，但今后仍需大量實驗驗證分析，以明確芩薊涼血合劑治療便秘的關(guān)鍵作用機制。