大腸桿菌快速檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

吳學(xué)斌，龐春穎，魏佳淇，郭云軒，顧峰

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；3.陜西省人民醫(yī)院，西安 710003）

近年來，由食源性病原體引起的疾病已成為主要公共衛(wèi)生問題之一。食源性病原體種類繁多，其中大腸桿菌O157：H7 是最為常見、嚴(yán)重的一種［1］。大腸桿菌O157：H7 是條件性致病菌，在一定條件下會(huì)導(dǎo)致腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血尿毒癥綜合征等疾病，甚至?xí)＜坝變汉腕w弱者生命，因此對(duì)食品和水源中的大腸桿菌O157：H7進(jìn)行快速、廣泛的檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，對(duì)于大腸桿菌的檢測(cè)主要采用培養(yǎng)基培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）等。培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法具有較好的特異性，但是整個(gè)過程復(fù)雜耗時(shí)，需持續(xù)約4 天，操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力；PCR 作為擴(kuò)增核酸的常用技術(shù)，具有較高的準(zhǔn)確性，但是由于DNA 提取、擴(kuò)增等樣品制備步驟復(fù)雜，操作過程易形成氣溶膠污染，成本較高，需要昂貴的熱循環(huán)儀和訓(xùn)練有素的專業(yè)人員，不適合現(xiàn)場(chǎng)及戶外檢測(cè)；ELISA 法大多用來進(jìn)行血清學(xué)診斷檢測(cè)生物樣品中是否存在抗原或抗體，盡管ELISA 測(cè)試靈敏度較高，但仍不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，因?yàn)镋LISA 需要大型精密儀器進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)和一定的孵育時(shí)間［2-5］。以上方法均在實(shí)際樣品應(yīng)用檢測(cè)時(shí)缺乏即時(shí)診斷所需的重要特征，即反應(yīng)快速和操作簡(jiǎn)便。近年來隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，建立了多種基于新型生物傳感器系統(tǒng)的檢測(cè)方法。其中，電化學(xué)生物傳感器由于其具備反應(yīng)迅速、檢測(cè)限低、信號(hào)讀取方便等優(yōu)勢(shì)，在臨床診斷及食品安全領(lǐng)域受到了研究人員的青睞，具有廣闊的應(yīng)用前景［6］。橫向流動(dòng)免疫分析法（Lateral Flow Immunochromatographic Assay，LFIA）是一種在20 世紀(jì)發(fā)展起來的體外檢測(cè)工具診斷技術(shù)，是即時(shí)檢測(cè)（Point of Care Testing，POCT）的主要技術(shù)之一［7］，它具有操作時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)效益大、適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的特點(diǎn)。例如核酸測(cè)試被認(rèn)為是診斷冠狀病毒引起的肺炎（COVID-19）的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。

針對(duì)以上分析，本系統(tǒng)基于電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析技術(shù)配合STM32 單片機(jī)設(shè)計(jì)了一種便攜式大腸桿菌快速檢測(cè)系統(tǒng)，完成了電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)的設(shè)計(jì)，改善了試紙條只能定性檢測(cè)的問題，建立了大腸桿菌濃度O157：H7 與電流強(qiáng)度的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌O157：H7 的快速定量檢測(cè)［8-10］。

1 檢測(cè)原理

本設(shè)計(jì)利用電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析技術(shù)和嵌入式技術(shù)設(shè)計(jì)一款大腸桿菌快速檢測(cè)系統(tǒng)。電化學(xué)免疫分析平臺(tái)可將滴加的大腸桿菌O157：H7 溶液濃度信息轉(zhuǎn)化為電流信號(hào)，該信號(hào)由絲網(wǎng)印刷電極傳輸?shù)角度胧较到y(tǒng)，嵌入式系統(tǒng)再對(duì)電流信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)、放大、處理和分析，最終計(jì)算出大腸桿菌O157：H7 溶液的濃度。

系統(tǒng)檢測(cè)原理框圖如圖1 所示。檢測(cè)時(shí)將待檢測(cè)液體滴加至電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)的樣品墊上，檢測(cè)液中的大腸桿菌O157：H7可與結(jié)合墊上的Fc-MI 偶聯(lián)物結(jié)合（如步驟①），隨后與Fc-MI 偶聯(lián)物結(jié)合的大腸桿菌O157：H7在測(cè)試墊與其特異性抗體結(jié)合（如步驟②），最后Fc-MI 偶聯(lián)物中含有的二茂鐵表現(xiàn)出電特性，產(chǎn)生的電流經(jīng)絲網(wǎng)印刷電極輸出到嵌入式檢測(cè)系統(tǒng)（如步驟③）。

圖1 系統(tǒng)檢測(cè)原理框圖

2 系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)

系統(tǒng)的設(shè)計(jì)基于電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析技術(shù)。系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)框圖如圖2 所示，分為電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)和嵌入式檢測(cè)系統(tǒng)兩部分。電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)負(fù)責(zé)接收滴加的大腸桿菌O157：H7 溶液，并將大腸桿菌溶液濃度信息轉(zhuǎn)化為電流信號(hào)。嵌入式檢測(cè)系統(tǒng)包括STM32 主控芯片及其外圍的各個(gè)電路，負(fù)責(zé)采集、放大、處理絲網(wǎng)印刷電極傳入的電流信號(hào)，并根據(jù)擬合函數(shù)計(jì)算大腸桿菌O157：H7 濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157：H7 的檢測(cè)。

圖2 系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)框圖

3 橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)

3.1 橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)結(jié)構(gòu)組成

電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)負(fù)責(zé)將大腸桿菌O157：H7 溶液的濃度信息轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。

平臺(tái)結(jié)構(gòu)如圖3 所示。平臺(tái)由五部分組成，包括樣品墊、結(jié)合墊、測(cè)試條、吸收墊和絲網(wǎng)印刷電極。樣品墊接收含有大腸桿菌O157：H7 的溶液，并作為過濾器幫助液體流動(dòng)。結(jié)合墊上的Fc-MI 偶聯(lián)物可與大腸桿菌O157：H7 結(jié)合形成靶標(biāo)Fc-MI 復(fù)合物。測(cè)試條上的特異性抗體可識(shí)別并捕獲與Fc-MI 結(jié)合的大腸桿菌O157：H7。絲網(wǎng)印刷電極提供電流回路，為平臺(tái)提供電壓的同時(shí)輸出電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的電流。

圖3 電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)結(jié)構(gòu)圖

3.2 橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)制備

電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)的制備包括絲網(wǎng)印刷電極的設(shè)計(jì)、橫向流動(dòng)裝置的制作以及ELFIA 測(cè)試條的功能化三步。

本研究采用三電極系統(tǒng)，包括工作電極（WE）、對(duì)電極（CE）和參比電極（RE）［11-12］。工作電極和對(duì)電極由石墨烯糊制成，參比電極由Ag/AgCl 油墨制成。

橫向流動(dòng)測(cè)試條由五個(gè)部分組成，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝化纖維素膜、吸收墊和絲網(wǎng)印刷電極。每個(gè)組件都安裝在背板上，組件之間有2 mm的重疊，而絲網(wǎng)印刷電極連接在背板和硝化纖維素膜之間。另外，還需制備結(jié)合墊所需的二茂鐵抗菌肽偶聯(lián)物（Fc-MI）。首先，將二茂鐵羧酸（10 mg）完全溶解在1 mL 的HEPES 緩沖液（50 mM，pH 7.4）中。然后在溶液中分別加入了10 mg NHS 和15 mg EDC。然后，通過在室溫下連續(xù)攪拌2 h，激活該混合物中二茂鐵羧酸上的羧基。然后，將200 μL 濃度為1 mg/mL 的抗菌肽MI（使用超純水溶解干粉）滴加入混合物中，在室溫下連續(xù)攪拌12 h。孵育后，將偶聯(lián)物在3 000 rpm 下離心10 min，以去除任何沉淀。然后，將上清液以11 000 rpm 離心30 min。將以這種方法制備的Fc-MI 偶聯(lián)物顆粒用超純水稀釋至1 mL，并在4 ℃下保存。

首先將1 μL 大腸桿菌O157：H7 抗體（1 mg/ml）應(yīng)用于硝化纖維素膜檢測(cè)區(qū)，在37 ℃下烘烤30 min。然后將制備的5 mL 的Fc-MI 放在結(jié)合墊上，最后在37 ℃下烘烤30 min。

完成上述三個(gè)步驟后，電化學(xué)橫向集成免疫分析平臺(tái)即可連接嵌入式檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)物圖如圖4 所示。

圖4 電化學(xué)橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)實(shí)物

4 嵌入式檢測(cè)系統(tǒng)

4.1 硬件設(shè)計(jì)

硬件電路主要由I/V 轉(zhuǎn)換電路、放大電路、濾波電路、A/D 轉(zhuǎn)換電路和電源模塊等構(gòu)成。I/V轉(zhuǎn)換電路負(fù)責(zé)將電化學(xué)集成免疫分析平臺(tái)輸出的電流信號(hào)轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)。放大電路將信號(hào)進(jìn)一步放大，以便信號(hào)檢測(cè)。濾波電路濾除噪聲，保證結(jié)果穩(wěn)定性。A/D 轉(zhuǎn)換電路則是將處理好的模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為單片機(jī)可識(shí)別的數(shù)字信號(hào)［13］。

主控單元采用ST 公司的STM32F407ZGT6 作為主控芯片，通過控制單片機(jī)的SPI 接口、ADC接口、IIC 接口與相應(yīng)的參數(shù)采集模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸，并且該單片機(jī)具有浮點(diǎn)運(yùn)算器并支持DSP功能，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)數(shù)字信號(hào)的處理與分析。主控單元資源分配如下：采用GPIOA9、GPIOA10 引腳的USART1 功能，通過CH340G 芯片構(gòu)成USB轉(zhuǎn)串口一鍵下載電路，實(shí)現(xiàn)程序的調(diào)試與下載；觸摸屏通信采用跳線帽轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)與USB 轉(zhuǎn)換電路共用USART1，進(jìn)行指令發(fā)送與接收；采用GPIOF7 引腳的ADC3 功能，對(duì)輸入的模擬信號(hào)進(jìn)行12 位模數(shù)轉(zhuǎn)換。

I/V 轉(zhuǎn)換電路采用AD825 運(yùn)算放大器，該芯片具有噪聲低、穩(wěn)定性高、抑制電源高頻噪聲、不易受溫度影響等優(yōu)點(diǎn)，其電路設(shè)計(jì)如圖5 所示。

圖5 I/V 轉(zhuǎn)換電路原理圖

I/V 轉(zhuǎn)換電路采用負(fù)反饋放大設(shè)計(jì)，電流信號(hào)由反相輸入端輸入，輸出端經(jīng)電阻與反向輸入端相連，放大倍數(shù)由輸出端與輸入端之間的等效電阻決定。同時(shí)，電路中采用T 型反饋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的大倍數(shù)放大，同時(shí)可避免大阻值電阻引入的噪聲干擾。Uout1的計(jì)算公式如下：

計(jì)算結(jié)果如下：

放大電路采用LF353 運(yùn)算放大器，采用二級(jí)放大設(shè)計(jì)，將信號(hào)放大相應(yīng)倍數(shù)，同時(shí)避免電路陷入自激狀態(tài)。LF353 芯片采用場(chǎng)效應(yīng)管作為差分輸入級(jí)，具有很高的輸入阻抗及較低的輸入噪聲電壓，輸出級(jí)為NPN 和PNP 構(gòu)成的互補(bǔ)射極跟隨器，具有較強(qiáng)的帶負(fù)載能力。放大電路原理如圖6 所示。

圖6 放大電路原理圖

圖中一級(jí)放大電路采用反向比例放大電路，Uin作為信號(hào)輸入，U1為一級(jí)放大后的信號(hào)，反饋電阻采用滑動(dòng)變阻器，可根據(jù)放大倍數(shù)的需要對(duì)反饋?zhàn)柚颠M(jìn)行調(diào)整，U1的計(jì)算公式如下：

二級(jí)放大電路采用差動(dòng)放大設(shè)計(jì)，R6=R9，R7=R10，Uout2的計(jì)算公式如下：

信號(hào)濾波電路的設(shè)計(jì)主要針對(duì)可充電鋰電池的干擾，可充電鋰電池產(chǎn)生的干擾信號(hào)頻率在100 MHz 左右。為降低噪聲對(duì)系統(tǒng)信號(hào)的干擾，本系統(tǒng)采用OP27 運(yùn)放芯片，設(shè)計(jì)低通濾波電路，針對(duì)干擾信號(hào)的頻率范圍，設(shè)置帶通截止頻率為2 Hz，濾波電路原理如圖7 所示。

圖7 濾波電路原理圖

濾波電路截止頻率計(jì)算公式如下：

濾波電路輸出電壓計(jì)算公式如下：

完成各個(gè)模塊電路的設(shè)計(jì)即可進(jìn)行系統(tǒng)PCB 板的焊接，其實(shí)物圖如圖8 所示。

圖8 系統(tǒng)PCB 實(shí)物

4.2 軟件設(shè)計(jì)

嵌入式系統(tǒng)程序設(shè)計(jì)主要包括系統(tǒng)各項(xiàng)功能初始化、指令的發(fā)送和信號(hào)的接收，解析接收的指令，并執(zhí)行對(duì)應(yīng)的功能，保證整個(gè)系統(tǒng)的有序運(yùn)行。系統(tǒng)運(yùn)行后，主程序調(diào)用初始化函數(shù)，對(duì)單片機(jī)I/O 口、復(fù)用映射、定時(shí)器、串口、中斷及中斷優(yōu)先級(jí)等參數(shù)進(jìn)行初始化設(shè)置。系統(tǒng)初始化完成后，等待指令的傳入，并對(duì)接收到的指令進(jìn)行判斷，然后解析指令完成相應(yīng)的操作。系統(tǒng)主程序的功能主要包括觸摸屏顯示、信號(hào)檢測(cè)、數(shù)據(jù)的處理和存儲(chǔ)等。系統(tǒng)主程序流程如圖9 所示。

圖9 系統(tǒng)主程序流程圖

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

5.1 橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)可行性測(cè)試

為測(cè)試電化學(xué)集成檢測(cè)平臺(tái)的可行性，選用大腸桿菌O157：H7 溶液和純凈水作對(duì)照組，利用電化學(xué)工作站進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果如圖10 所示。

圖10 可行性測(cè)試結(jié)果

由圖10 可知，在滴加陰性溶液時(shí)，電化學(xué)集成橫向免疫分析平臺(tái)幾乎不產(chǎn)生電流響應(yīng)。滴加含有大腸桿菌O157：H7 的溶液時(shí)，平臺(tái)在0.1～0.4 V 范圍內(nèi)有較明顯的電流響應(yīng)，并且在0.2～0.3 V 之間取最大值。綜上所述，電化學(xué)集成橫向免疫分析平臺(tái)能明顯區(qū)分陰性、陽(yáng)性，有較好的可行性。

5.2 橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)靈敏性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)配置10 組濃度分別為0、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7 溶液，滴入電化學(xué)集成免疫分析平臺(tái)樣品墊檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖11 所示。

圖11 靈敏性測(cè)試結(jié)果

從圖中可以看出，電流響應(yīng)強(qiáng)度隨大腸桿菌O157：H7 溶液濃度的增加而增強(qiáng)，并且不同濃度之間表現(xiàn)出明顯的差異，說明電化學(xué)集成免疫分析平臺(tái)具有較好的靈敏性。

5.3 橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)特異性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備4 組濃度為106CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、金黃葡萄球菌、李斯特菌溶液，在相同條件下進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 特異性測(cè)試結(jié)果

從圖中可以看出，大腸桿菌O157：H7 電流響應(yīng)非常明顯，沙門氏菌有輕微的電流響應(yīng)，其他菌種幾乎無電流響應(yīng)，說明電化學(xué)集成免疫分析平臺(tái)具有較好的特異性。

5.4 濃度表達(dá)式擬合

為得到檢測(cè)電信號(hào)大小與物質(zhì)濃度之間的關(guān)系，配制9 組濃度為101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液樣品，滴入測(cè)試條進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。根據(jù)電流信號(hào)與待測(cè)樣品濃度關(guān)系，用最小二乘法做線性回歸，擬合曲線如圖13 所示。

圖13 大腸桿菌濃度檢測(cè)擬合結(jié)果

由圖可知，電流強(qiáng)度的大小與待測(cè)物濃度有明顯線性關(guān)系，線性擬合后，檢測(cè)公式如下：

在檢測(cè)范圍102～109CFU/mL 濃度內(nèi)，線性擬合度R2=0.985 2，電流強(qiáng)度與大腸桿菌O157：H7溶液濃度有良好的線性擬合度。

5.5 系統(tǒng)誤差測(cè)試

在進(jìn)行誤差測(cè)試時(shí)，使用上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)的電化學(xué)工作站分別對(duì)濃度為102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液樣品進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，測(cè)試過程重復(fù)5 次，取平均值記錄，測(cè)試數(shù)據(jù)如表1 所示。

表1 系統(tǒng)誤差測(cè)試數(shù)據(jù)

根據(jù)表1可知，本系統(tǒng)檢測(cè)相對(duì)誤差小于4.5%，準(zhǔn)確性較好。

5.6 系統(tǒng)重復(fù)性測(cè)試

系統(tǒng)的重復(fù)性測(cè)試是衡量檢測(cè)儀器穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，是對(duì)檢測(cè)結(jié)果離散程度的反應(yīng)。重復(fù)性常采用變異系數(shù)CV值表示，其計(jì)算公式如下：

式中，σ表示樣本標(biāo)準(zhǔn)差；表示樣本均值。計(jì)算得到的CV值越小，則表示系統(tǒng)檢測(cè)重復(fù)性檢測(cè)越穩(wěn)定。

進(jìn)行系統(tǒng)重復(fù)性檢測(cè)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室配置標(biāo)準(zhǔn)液濃度103CFU/mL、106CFU/mL、109CFU/mL 三種濃度指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試，每組測(cè)試重復(fù)10 次，并計(jì)算檢測(cè)樣本濃度均值以及標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行系統(tǒng)重復(fù)性測(cè)試。通過計(jì)算，CV值分別為3.7%、2.1%、0.3%，結(jié)果表明隨著檢測(cè)濃度的升高，變異系數(shù)越小，系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果越穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)試曲線如圖14 所示。

圖14 系統(tǒng)重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

6 結(jié)論

本系統(tǒng)采用電化學(xué)免疫分析技術(shù)，設(shè)計(jì)電化學(xué)集成橫向流動(dòng)免疫分析平臺(tái)，選用STM32F407微處理器作為系統(tǒng)控制核心，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品溶液中大腸桿菌O157：H7 的快速定量檢測(cè)。該系統(tǒng)體積小，操作簡(jiǎn)單，只需“一鍵式”操作，即可在10 min 內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，適合家用普及。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)的檢測(cè)誤差小于4.5%，系統(tǒng)重復(fù)誤差小于3.7%，檢測(cè)限達(dá)到102CFU/mL，可有效用于大腸桿菌O157：H7 的檢測(cè)。