黃芩、貓眼草、連翹單味中藥體外抗HIV-1病毒活性的研究*

李承乘,張清燕,劉 真,鄧博文,楊瑤瑤,沈俊嶺,李 強

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心,河南 鄭州 450000)

全球人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染人數(shù)已超過6 000萬,約3 000萬感染者死于艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS),使得目前AIDS的防治任務(wù)依然十分艱巨[1-2]。AIDS的治療主要采取兩種方案,即高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART)和中醫(yī)藥治療。HAART療法臨床效果顯著,但有毒副作用大、耐藥率高等缺陷。中藥在傳統(tǒng)理論研究與應(yīng)用方面有著堅實的基礎(chǔ),研究[3-4]證明中藥能有效降低HIV病毒載量,減緩AIDS病情。部分中醫(yī)藥復(fù)方也具有抗病毒作用[5-8]。因此篩選出更多有效的抗HIV中藥具有重要意義。祛毒顆粒是臨床治療HIV的常用中藥復(fù)方,由黃芩、連翹、貓眼草、紅辣蓼、生甘草等組成,有解毒散結(jié)之功效,臨床效果較好,毒副反應(yīng)小。方中黃芩清熱燥濕,瀉火解毒,為君藥;連翹清熱解毒,散熱消癰,為臣藥;貓眼草祛痰散結(jié),拔毒殺蟲,為佐藥。本研究從體外實驗角度探索組方中黃芩、貓眼草、連翹單味中藥的抗病毒效果,選用重組質(zhì)粒PLAI(含HIV包膜蛋白基因)和JRFC(含HIV骨架基因)制備假病毒,建立抗HIV-1藥物篩選平臺,觀察黃芩、貓眼草、連翹單味中藥對HIV假病毒感染MAGI-CCR5細(xì)胞系的影響,評價其抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

293T細(xì)胞,來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫,批號GNHu17;DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞, 來源于生工生物工程(上海)股份有限公司,批號B528413;MAGI-CCR5細(xì)胞,重組質(zhì)粒PLAI、JRFC,由中國科學(xué)院上海巴斯德研究所贈送。

1.2 藥品、試劑與儀器

黃芩、連翹和貓眼草水煎劑由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部制備。分別取黃芩、連翹和貓眼草各50 g,加入500 mL純水,使用加熱回流系統(tǒng)水煎3次,每次1 h。濃縮藥液,最終制得35 mL浸膏。取500 μL 浸膏,加入2 mL DMEM培養(yǎng)基,混勻后過濾備用。培養(yǎng)基DMEM,美國海克隆公司產(chǎn)品,批號SH30022.01;質(zhì)粒提取試劑盒,德國Macherey-Nagel公司產(chǎn)品,批號740410.50;脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染試劑盒,美國英杰公司產(chǎn)品,批號11668019;熒光素酶檢測試劑盒, 普洛麥格生物技術(shù)公司產(chǎn)品,批號E1501。NanoVue Plus型核酸蛋白定量測定儀,美國通用電氣公司產(chǎn)品;E1501型熒光素酶檢測系統(tǒng),普洛麥格生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 重組質(zhì)粒的保存與鑒定

取制備好的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞懸液100 μL,加入30 μL質(zhì)粒混勻,置于冰水混合物中45 min,43 ℃水浴中90 s,再轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻15 min;管內(nèi)加800 μL無抗性LB培養(yǎng)基混勻,置于搖床上以振幅40 mm、轉(zhuǎn)速150 r/min、37 ℃下培養(yǎng)1 h;轉(zhuǎn)移感受態(tài)細(xì)胞至氨芐抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過夜;挑取轉(zhuǎn)染成功的大腸桿菌菌株大量擴增,提取質(zhì)粒,進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定及熒光素酶報告基因測序;凍存轉(zhuǎn)化成功的菌落。

1.4 假病毒篩選平臺的構(gòu)建

將293T細(xì)胞傳代至密度為80%左右;按照 3∶1比例加入質(zhì)粒PLAI和JRFC共 8 μg,脂質(zhì)體 2 000 轉(zhuǎn)染試劑 8 μL,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)50 mL /L CO2培養(yǎng)箱中;6 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h;收集病毒上清液,稀釋為不同濃度梯度,感染MAGI-CCR5細(xì)胞。將空白細(xì)胞設(shè)為對照組;將空白細(xì)胞加不同濃度病毒上清液設(shè)為實驗組,設(shè)5個梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16),每個梯度4個復(fù)孔。采用熒光素酶檢測試劑,在化學(xué)發(fā)光儀上測定每孔的相對熒光單位(relative light unit, RLU)以測定假病毒活性滴度,判斷假病毒篩選平臺是否構(gòu)建成功。進行半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(tissue culture infective dose 50%,TCID50)測定,選取100TCID50病毒量用于藥物抑制試驗。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 對MAGI-CCR5細(xì)胞無毒性的單味中藥溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選

通過中藥水煎液體外對MAGI-CCR5細(xì)胞的毒性實驗確定藥物的相對安全劑量,采用MTT法檢測單味中藥對MAGI-CCR5細(xì)胞增殖情況的影響。將MAGI-CCR5細(xì)胞接種于96孔板中,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)50 mL /L CO2條件下培養(yǎng)過夜;棄上清液,重新加入完全培養(yǎng)基DMEM。將空白細(xì)胞設(shè)為對照組,加入100 μL完全培養(yǎng)基;將空白細(xì)胞加中藥設(shè)為實驗組。以制備好的中藥水煎劑為初始濃度,10倍比稀釋加入培養(yǎng)板中,每孔100 μL,設(shè)置6個梯度(1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000),每梯度4個復(fù)孔;96孔板置于37 ℃、50 mL /L CO2條件下培養(yǎng)48 h;計數(shù)檢測MAGI-CCR5細(xì)胞生長狀態(tài),篩選出對細(xì)胞無毒性的最合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5.2 單味中藥體外假病毒感染MAGI-CCR5細(xì)胞抑制實驗

將96孔板中MAGI-CCR5細(xì)胞培養(yǎng)基上清液棄去,設(shè)置對照組1為空白細(xì)胞,對照組2為空白細(xì)胞加病毒,實驗組為空白細(xì)胞加病毒加中藥;各組別藥物以上述毒性實驗篩選出的最合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為初始質(zhì)量分?jǐn)?shù),2倍等比稀釋,設(shè)置8個稀釋梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128);除對照組1外,每孔加入50 μL病毒(100TCID50),在37 ℃、50 mL/L CO2下培養(yǎng)6 h后,將對照組2更換為完全培養(yǎng)基,將實驗組更換為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中藥煎液;48 h后,熒光素酶檢測試劑盒測定每孔RLU。計算藥物對假病毒的抑制率。抑制率=[1-(實驗組發(fā)光值-對照組1發(fā)光值)/(對照組2發(fā)光值-對照組1發(fā)光值)]×100%

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 假病毒篩選平臺構(gòu)建結(jié)果

實驗組不同濃度梯度的相對熒光單位均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。結(jié)果表明,假病毒篩選藥物平臺構(gòu)建成功。

表1 不同濃度梯度病毒上清液感染MAGI-CCR5細(xì)胞的熒光素酶值對比

2.2 3種單味中藥對MAGI-CCR5細(xì)胞的無毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選結(jié)果

黃芩、貓眼草、連翹單味中藥對MAGI-CCR5細(xì)胞的毒性較小,高劑量有毒性作用,低劑量無毒作用(P<0.05),甚至部分藥物的最低劑量對細(xì)胞有促進增殖作用(P>0.05)。藥物對細(xì)胞的抑制增殖作用呈現(xiàn)出劑量依賴性趨勢。黃芩、貓眼草、連翹均在藥物稀釋比例為1∶100 000時對細(xì)胞的增殖不再具有抑制作用,因此選擇2.17 mg/L黃芩、3.45 mg/L貓眼草、2.50 mg/L連翹作為其抗病毒研究起始劑量。見表2。

表2 黃芩、貓眼草、連翹對MAGI-CCR5細(xì)胞的無毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)篩選結(jié)果

2.3 3種單味中藥體外對假病毒感染MAGI-CCR5的抑制實驗結(jié)果

黃芩、貓眼草、連翹單味中藥均有體外抗HIV假病毒作用,且與質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)趨勢,分別黃芩2.17 mg/L、貓眼草3.45 mg/L、連翹2.50 mg/L時表現(xiàn)出最高抑制率,依次是41.87%、37.38%、14.12%。見表3。

表3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)黃芩、貓眼草、連翹對HIV假病毒的抑制率對比

3 討 論

研究表明,HIV-1假病毒與活病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的很多環(huán)節(jié)相同,因此在抗HIV-1藥物的篩選、藥物抗病毒效果評價等研究中,HIV假病毒檢測系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用[9]。多項研究利用HIV-1假病毒在細(xì)胞水平進行抗HIV-1藥物的篩選、對患者體內(nèi)HIV-1毒株進行耐藥性分析,取得較好效果[10-12]。本研究基于重組質(zhì)粒PLAI和重組質(zhì)粒JRFC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,成功包裝出假病毒,建立抗HIV-1假病毒篩選平臺,與活病毒相比具有較高的生物安全性,適用于普通實驗室對抗HIV-1藥物篩選的需求。在此模型中,不同稀釋度的假病毒感染MAGI-CCR5細(xì)胞后,熒光素酶的表達水平與病毒稀釋度呈明顯的劑量依賴效應(yīng),較靈敏地體現(xiàn)了HIV-1的復(fù)制水平,其特點符合藥理篩選模型的要求。

病毒復(fù)制的晚期步驟發(fā)生在報告基因表達之后,故檢測報告基因的表達不能反映藥物對病毒復(fù)制晚期的抑制情況,該方法不適用于蛋白酶等晚期過程抑制劑的活性篩選[13-14]。由于課題組所聯(lián)系HIV/AIDS患者均為河南地區(qū)人員,大部分為HIV-1 B’型病毒感染,因此研究中只采用了含B亞型ENV基因的質(zhì)粒制備假病毒毒株,所建立的假病毒篩選體系符合此型HIV/AIDS治療的中藥及臨床中藥復(fù)方的抗病毒篩選需求,后期可制備多種類型假病毒毒株以對藥物進行更全面篩選,進一步優(yōu)化和完善篩選平臺。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,黃芩的主要有效成分是黃酮類成分,其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等方面具有較好效果[15-16]。連翹的主要成分為連翹苷和連翹酯苷,具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性,主治熱病初起、風(fēng)熱感冒、發(fā)熱、心煩、咽喉腫痛等[17-18]。貓眼草中含有萜類、黃酮類、甾醇、揮發(fā)油和酚類等多種化學(xué)成分,具有祛寒、鎮(zhèn)咳、平喘、拔毒止癢、利尿消腫之功。貓眼草內(nèi)服有抗菌抗病毒作用,可用于治療呼吸系統(tǒng)疾病,還可抗腫瘤;外用可治療淋巴結(jié)結(jié)核、皮癬等疾病[19-20]。多種清熱解毒中藥如紫花地丁[21]、夏枯草[22-23]、穿心蓮[24-25]、黃芩[30]、魚腥草[26]、金銀花[27-28]等對HIV病毒的增殖具有抑制作用。紫花地丁的二甲基亞砜、夏枯草的含硫多糖、穿心蓮的內(nèi)酯具有抗HIV病毒作用的成分。通過對中藥有效成分的藥理分析,發(fā)現(xiàn)了諸多抗HIV活性物。如：栝樓中分離出的天花粉蛋白目前已被用于AIDS的臨床治療[29]。又如：黃芩苷能夠抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,且對酶活性的抑制作用有濃度依賴關(guān)系;其對HIV-1假病毒的抑制作用隨著給藥濃度的增高而增大,100 μmol/L黃芩苷的抑制率為60%左右[30]。

近年來,中醫(yī)藥防治AIDS在中藥復(fù)方的研發(fā)方面取得了較好的成果[31]。益艾康膠囊[32-33]、唐草片[34-35]、復(fù)方三黃散[36-37]、艾寧顆粒[38-39]等中藥復(fù)方制劑在臨床上應(yīng)用較為廣泛且臨床效果確切。同時實驗研究證明這些中藥復(fù)方具有較好的抗病毒作用,使CD4淋巴細(xì)胞的比例升高、患者的機體免疫能力明顯改善[40]。本研究前期建立合理的假病毒平臺,利用此平臺對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的黃芩、貓眼草、連翹單味中藥進行篩選,通過熒光素酶報告基因的表達檢測,觀察藥物對HIV假病毒影響,體外篩選其抗病毒作用。結(jié)果顯示：單味中藥黃芩、貓眼草具有較好的體外抗HIV病毒的作用,且抗病毒作用與藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系;連翹的抗HIV病毒作用相對較弱。此結(jié)果對中藥的有效成分研究提供了實驗依據(jù),為開發(fā)我國自主產(chǎn)權(quán)的抗AIDS天然藥物提供了數(shù)據(jù)支撐。