基于生物信息學(xué)探究NR1H4在慢性萎縮性胃炎及藥物預(yù)測中的作用

彭曉婷 王文素 何典城 詹亞梅 游紹偉

[摘要]?目的?通過生物信息學(xué)方法獲得慢性萎縮性胃炎（chronic?atrophic?gastritis，?CAG）的差異基因，預(yù)測治療CAG的小分子藥物。方法?通過基因表達綜合（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫獲取2份CAG芯片（GSE27411、GSE116312）基因表達樣本，利用R語言篩選出CAG差異表達基因，獲得CAG免疫相關(guān)基因進行基因本體論（gene?ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）分析。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心基因，進一步研究核心基因的免疫浸潤，預(yù)測其小分子化合物，通過MOE2022進行分子對接，通過GEPIA2網(wǎng)站進行生存分析。結(jié)果?基于GEO數(shù)據(jù)庫篩選出差異基因517個。GO富集分析發(fā)現(xiàn)主要涉及粒細胞趨化性、白細胞趨化性、中性粒細胞趨化性等生物過程。KEGG富集分析顯示主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、核因子κB信號通路、白細胞介素-17信號通路。PPI網(wǎng)絡(luò)篩選前6個核心基因即NR1H4、CCK、CCL20、CXCL1、LCN2、SAA1，通過相關(guān)驗證，NR1H4作為核心基因。免疫細胞浸潤分析結(jié)果顯示中央記憶CD8?T細胞、效應(yīng)記憶CD4?T細胞、γδT細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞等免疫細胞可能參與CAG的發(fā)生發(fā)展，而中性粒細胞與NR1H4呈正相關(guān)。分子對接顯示柯里拉京、豆甾醇、梔子苷、桔皮素、鵝去氧膽酸、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯6種小分子藥物與NR1H4有較好的結(jié)合力。結(jié)論?本研究初步探討CAG的潛在機制，NR1H4作為關(guān)鍵基因與中性粒細胞可能在CAG“炎-癌轉(zhuǎn)化”進程中具有重要意義，可為CAG的“炎–癌轉(zhuǎn)化”機制研究提供一定的參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]?慢性萎縮性胃炎；生物信息學(xué)；NR1H4；差異基因；免疫浸潤

[中圖分類號]?R573.32??????[文獻標(biāo)識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.04.002

Study?on?the?role?of?NR1H4?in?chronic?atrophic?gastritis?and?drug?prediction?based?on?bioinformatics

PENG?Xiaoting1，?WANG?Wensu2，?HE?Diancheng3，?ZHAN?Yamei4，?YOU?Shaowei3

1.The?Second?Clinical?Medical?College，?Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guiyang?550002，?Guizhou，?China;?2.Department?of?Cadre?Healthcare，?the?Second?Affiliated?Hospital?of?Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guiyang?550003，?Guizhou，?China;?3.Department?of?Gastroenterology，?the?Second?Affiliated?Hospital?of?Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guiyang?550003，?Guizhou，?China;?4.Department?of?Pharmacy，?Guizhou?Provincial?Peoples?Hospital，?Guiyang?550002，?Guizhou，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?differential?gene?expression?profile?and?small?molecule?drugs?for?chronic?atrophic?gastritis?（CAG）?by?bioinformatics?technology.?Methods?Two?gene?expression?samples?of?CAG?chips?（GSE27411，?GSE116312）?were?obtained?through?the?Gene?Expression?Synthesis?（GEO）?database，?screen?the?differentially?expressed?genes?（DEGs）?of?CAG?by?R?language，?and?CAG?immune-related?genes?were?obtained?for?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?analysis.?Protein-protein?interaction?（PPI）?network?was?constructed?using?STRING?database?to?screen?out?core?genes，?further?study?on?immune?invasion?of?core?genes?based?on?GSE27411?dataset，?small?molecular?compounds?interacting?with?core?genes?were?predicted，?molecular?docking?was?carried?out?by?MOE2022，?and?survival?analysis?was?carried?out?by?GEPIA2?website.?Results?A?total?of?517?DEGs?were?screened?out?based?on?GEO?database.?GO?function?enrichment?analysis?found?that?it?mainly?involved?in?granulocyte?chemotaxis、leukocyte?chemotaxis?and?neutrophil?chemotaxis?biological?processes.?KEGG?pathway?enrichment?analysis?showed?that?it?mainly?involved?in?cytokine-cytokine?receptor?interaction、nuclear?factor?kappa?B?signaling?pathway、interleukin-17?signaling?pathway.?Six?key?genes?of?NR1H4、CCK、CCL20、CXCL1、LCN2、SAA1?were?obtained?by?PPI?network，?through?relevant?verification，?NR1H4?was?regarded?as?the?core?gene.?Immune?cell?infiltration?analysis?showed?that?central?memory?CD8?T?cell、effector?memeory?CD4?T?cell、gamma?delta?T?cell、natural?killer?T?cell、neutrophil?and?other?immune?cells?may?be?involved?in?the?development?of?CAG，?and?the?neutrophil?was?positively?correlated?with?NR1H4.?It?was?predicted?that?six?small?molecular?drugs，?corilagin，?stigmasterol，?geniposide，?tangeretin，?chenodeoxycholic?acid?and?epigallocatechin?3-gallate，?have?good?binding?force?with?NR1H4.?Conclusion?The?potential?mechanism?of?CAG?is?preliminarily?explored?in?this?study，?the?key?gene?of?NR1H4?and?neutrophil?may?play?an?important?role?in?the?“inflammatory?cancer?transformation”?process?of?CAG，?which?can?provide?a?certain?reference?for?the?study?of?the?“inflammatory?cancer?transformation”?mechanism?of?CAG.

[Key?words]?Chronic?atrophic?gastritis;?Bioinformatics;?NR1H4;?Differentially?expressed?genes;?Immune?infiltration

慢性萎縮性胃炎（chronic?atrophic?gastritis，CAG）是指胃腺丟失，伴或不伴化生或假幽門腺化生的一種慢性炎癥性胃腸疾病，在胃“炎-癌轉(zhuǎn)化”進展中發(fā)揮重要作用，屬胃癌前狀態(tài)[1]。CAG無特異性臨床表現(xiàn)，部分患者可無任何癥狀，部分患者表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作性上腹痛、腹脹和飽脹感，可伴焦慮、睡眠障礙等心身疾病，嚴(yán)重影響日常生活，目前治療CAG主要以根除幽門螺桿菌（helicobacter?pylori，Hp）、抑酸、補充葉酸及中醫(yī)藥等治療為主，總體療效欠理想[2]。長期CAG有較大風(fēng)險進展為胃癌，因此，探索CAG發(fā)病機制，尋找新的治療靶點，預(yù)測相關(guān)分子標(biāo)志物及新的治療手段對防控“炎-癌轉(zhuǎn)化”具有重要意義。生物信息分析可預(yù)測基因與分子機制的聯(lián)系，初步篩選與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，為疾病的機制研究提供新的靶標(biāo)和思路。本研究基于生物信息學(xué)獲得CAG的差異基因，并探索新的治療手段。

1??資料與方法

1.1??數(shù)據(jù)獲取

從美國生物技術(shù)信息中心基因表達綜合（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.?nlm.nih.gov/geo/）收集CAG相關(guān)數(shù)據(jù)，獲得訓(xùn)練集GSE27411中6例CAG患者和6例健康對照（healthy?control，HC）的基因表達樣本及驗證集GSE116312中3例CAG患者和7例HC的基因表達樣本。從Immport數(shù)據(jù)庫（https：//www.immport.org/）中下載免疫相關(guān)基因，共獲得1793個。

1.2??差異基因表達分析

使用R軟件（版本4.2.20）中l(wèi)imma程序包分析GSE27411數(shù)據(jù)集的差異基因，其中以P<0.05且|LogFC|>1為條件進行篩選，并將排序靠前的結(jié)果進行可視化分析。同時使用Pheatmap程序包制作差異基因熱圖及使用ggplot2程序包制作火山圖。

1.3??免疫相關(guān)基因獲取及基因集富集分析

將差異基因與免疫相關(guān)基因取交集，即為CAG中的免疫相關(guān)基因，制作韋恩圖，通過R軟件用clusterProfiler包進行基因本體論（gene?ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路富集分析，設(shè)置P值Cutoff=0.05，Q值Cutoff=0.05，并將排序靠前的結(jié)果進行可視化分析。

1.4??蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)制作及核心基因的獲取驗證

將共同基因?qū)隨TRING11.5分析平臺（https：//?cn.string-db.org/），物種設(shè)置為“Homo?sapiens”（人類），構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-?protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)并進行可視化。將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape的cytoHubba插件，依據(jù)Betweenness計算方法進行拓撲結(jié)構(gòu)分析、篩選核心基因。同時基于驗證集GSE116312采用Wilcoxon檢驗進行表達差異驗證，驗證通過即為核心基因。

1.5??免疫浸潤分析

基于GSE27411數(shù)據(jù)集進一步研究核心基因免疫浸潤，使用GSVA程序包中ssGSEA算法可量化樣本中免疫細胞比例。通過ssGSEA算法對GSE27411數(shù)據(jù)集進行免疫浸潤分析，采用Wilcoxon檢驗CAG與HC之間免疫浸潤表達的差異，采用Ccrrplot程序包Spearman檢驗免疫相關(guān)基因與28個浸潤免疫細胞的相關(guān)性。

1.6??藥物預(yù)測、分子對接驗證、生存分析

通過HERB數(shù)據(jù)庫預(yù)測核心基因相互作用的小分子化合物，將預(yù)測小分子化合物進行分子對接。NR1H4的核心靶蛋白晶體結(jié)構(gòu)從RCSB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/pdb）下載，而小分子化合物2D結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.?nc-bi.nlm.nih.gov/）下載。MOE2022軟件進行分子對接并計算靶蛋白和小分子之間的相互作用能量。對接前，用MOE2022軟件自帶QuickPrep設(shè)置處理受體蛋白，包括加氫、質(zhì)子化等。使用MOE2022自帶Energy?Minimize設(shè)置對活性成分進行能量最小化。分子對接以MOE2022軟件General模型分析配體和受體的結(jié)合特性，得分越低，配體與靶蛋白的結(jié)合越穩(wěn)定。使用GEPIA2網(wǎng)站預(yù)測NR1H4在胃癌中的無病生存期以評價治療后療效。

2??結(jié)果

2.1??數(shù)據(jù)處理

GSE27411數(shù)據(jù)集中6例CAG患者和6例HC繪制差異基因火山圖和熱圖，篩選出上調(diào)基因384個，下調(diào)基因133個，見圖1。

2.2??免疫相關(guān)基因獲取及基因集富集分析

差異基因與免疫相關(guān)基因取交集得到69個CAG中的免疫相關(guān)基因，并進行KEGG和GO分析，見圖2。GO富集分析主要涉及粒細胞趨化性、白細胞趨化性、中性粒細胞趨化性等生物過程。KEGG中存在細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、核因子κB（nuclear?factor-κB，NF-κB）、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）等信號通路。

2.3??PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因

CAG免疫相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)節(jié)點68個，邊128條，平均度值3.76，圖中節(jié)點的大小及其顏色的深淺與其度值成正比，見圖3A。采用Cytoscape的cytoHubba插件，基于Betweenness計算取前6個核心基因即NR1H4、CCK、CCL20、CXCL1、LCN2、SAA1，見圖3B?；隍炞C集GSE116312驗證，其中只有NR1H4提示具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），即以NR1H4為本研究的核心基因，見圖3C。

2.4??免疫浸潤分析

使用ssGSEA算法估計GSE27411數(shù)據(jù)集中CAG患者和HC中28個免疫細胞的比例。研究發(fā)現(xiàn)GSE27411數(shù)據(jù)集中CAG患者和HC的中央記憶CD8?T細胞、效應(yīng)記憶CD4?T細胞、γδT細胞、自然殺傷T細胞及中性粒細胞比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4A；上述免疫細胞可能參與CAG的發(fā)生發(fā)展，其中中性粒細胞與NR1H4呈正相關(guān)（r>0.6，P<0.05），見圖4B。

2.5??藥物預(yù)測、分子對接及無病生存期

通過HERB數(shù)據(jù)庫預(yù)測特征基因NR1H4潛在小分子化合物，獲得柯里拉京、豆甾醇、梔子苷、桔皮素、鵝去氧膽酸、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯6個小分子化合物。分子對接能量低的配對是NR1H4-柯里拉京（–7.3663kcal/mol），能量最高的配對是NR1H4-豆甾醇（–6.298kcal/mol），全部對接能量值均<–5kcal/mol，提示有良好的對接活性，見表1。從GEPIA2網(wǎng)站獲得NR1H4在胃癌患者中的無病生存期結(jié)果，NR1H4低表達組胃癌患者的無病生存期顯著長于NR1H4高表達組（P<0.05），見圖5。

3??討論

胃癌是全球第六大常見癌癥，第四大癌癥死亡原因，長期慢性炎癥被認為是腫瘤發(fā)展的標(biāo)志[3]。CAG作為胃“炎-癌轉(zhuǎn)化”中的重要一環(huán)受多種因素的影響，但其發(fā)生機制目前仍未有確切的定論，多種因素均可能參與其中，基因的調(diào)控作用或許是其發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選出CAG相關(guān)數(shù)據(jù)集，最終篩選出CAG差異表達基因進行GO分析和KEGG分析。GO主要富集于抗微生物體液反應(yīng)、粒細胞趨化性、白細胞趨化性、髓樣白細胞遷移、中性粒細胞趨化性等生物過程；KEGG分析主要涉及

細胞因子-細胞因子受體相互作用、NF-κB信號通路、IL-17信號通路等炎癥免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路。細胞因子-細胞因子受體相互作用通路包含15個基因中的7個，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β是參與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移的重要刺激因子，其功能表現(xiàn)為抑制免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞，并在CAG、腸化生、胃癌中表達上調(diào)[4]。NF-κB在炎癥反應(yīng)、細胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌中均為陽性表達，且逐漸增強[5-6]。通過其上、下游的NF-κB蛋白表達調(diào)控胃黏膜上皮細胞的凋亡與增殖，從而逆轉(zhuǎn)胃“炎-癌轉(zhuǎn)化”發(fā)生[7]。IL-17信號通路參與炎癥反應(yīng)、自身免疫疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可增強中性粒細胞的浸潤及促進新生血管生成導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生，還可激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子分泌，改變腫瘤的炎癥微環(huán)境，促進胃癌細胞的遷移和侵襲[8-10]。以上提示CAG的發(fā)生發(fā)展與多種炎癥途徑和免疫相關(guān)。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，NR1H4作為核心基因可能在CAG病程中，甚至在“炎-癌轉(zhuǎn)化”病程中發(fā)揮重要作用。NR1H4又稱法尼酯衍生物X受體（Farnesoid?X?receptor，F(xiàn)XR），相關(guān)研究表明FXR激活可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路降低炎癥反應(yīng)[11-12]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)脫氧膽酸通過激活FXR-NF-κB通路，參與正常胃上皮細胞中CDX2和MUC2的異位表達，從而導(dǎo)致胃黏膜腸化生。

免疫細胞浸潤分析結(jié)果提示，中性粒細胞與NR1H4呈正相關(guān)。中性粒細胞是浸潤最多的免疫細胞，有研究顯示腫瘤微環(huán)境中浸潤的嗜中性粒細胞可削弱T細胞免疫，促進胃癌的發(fā)展，活化的中性粒細胞與胃癌進展相關(guān)，且與患者存活率呈負相關(guān)[14]。中性粒細胞以CXC趨化因子依賴性方式被吸引到胃癌環(huán)境中，中性粒細胞、B7-H2可能是CD4+?T細胞產(chǎn)生IL-17A的主要驅(qū)動因素之一，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[15]。

通過HERB數(shù)據(jù)庫查詢獲得6種特異性針對NR1H4的小分子化合物。分子對接結(jié)果顯示其均與核心基因NR1H4有較好的親和力。柯里拉京具有抗炎、保肝、抗腫瘤活性，對正常細胞毒性較小，能抑制胃癌細胞增殖、凋亡和自噬，發(fā)揮較強的抗腫瘤活性[16-17]；豆甾醇具有很強的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，可介導(dǎo)AMP活化蛋白激酶活化，并通過調(diào)節(jié)NF-κB或核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白通路發(fā)揮抗炎作用[18-19]；梔子苷具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性，通過抑制相關(guān)炎癥信號通路，減少炎癥反應(yīng)及發(fā)揮抗腫瘤作用[20-21]；桔皮素可通過抑制Notch-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和miR-410表達上調(diào)提高胃癌細胞的輻射敏感性及抑制輻射誘導(dǎo)的上皮–間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[22]；表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵的細胞信號通路，發(fā)揮抗炎、抗增殖和細胞凋亡誘導(dǎo)作用[23-26]；鵝去氧膽酸是膽汁酸受體和轉(zhuǎn)錄因子FXR最有效的天然激動劑，朱晗等[27]發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸可降低BV2細胞中炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子-α和IL-1β的表達，抑制NF-κB信號通路及Akt的激活?；谒幚矸治觯J為以上小分子化合物可能是抑制CAG及其“炎-癌轉(zhuǎn)化”進程中的關(guān)鍵因素。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)篩選出與CAG密切相關(guān)的基因NR1H4，對其進行深入研究可有助于進一步闡釋CAG發(fā)生、發(fā)展的機制及小分子藥物的預(yù)測，為藥物治療提供潛在靶點，也為病理篩查提供理論依據(jù)。但本研究尚缺少基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)的驗證，后續(xù)將繼續(xù)收集臨床樣本，對篩選出的關(guān)鍵基因進行深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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