6 株鼠李糖乳桿菌的安全性評價

◆作者：張?zhí)鹛?林顯華 呂文亮 徐海燕 王紅 谷巍 王俊賢

◆單位：山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）是一種乳酸桿菌，革蘭氏陽性，無質(zhì)粒，不能利用乳糖，可以代謝單糖。通常耐受胃腸道條件下的低pH 值、膽汁鹽、厭氧環(huán)境（Riaz Rajoka M S 等，2017），已被證明對人體健康有多種益處，在食品、保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域應用廣泛。近年來越來越多的研究將鼠李糖乳桿菌應用于畜禽行業(yè)，劉耀東等（2021）的研究表明，鼠李糖乳桿菌微膠囊添加到日糧中可以提高仔豬生產(chǎn)性能和免疫力；鼠李糖乳桿菌53103 應用于斷奶仔豬，可顯著提高回腸黏膜sIgA 含量及血清中IgG、IgA 水平，可改善小腸和盲腸黏膜的微生物組成（耿婷婷等，2021）；鼠李糖乳桿菌MLGA可以通過提高血清中抗炎細胞因子水平以及降低促炎細胞因子的水平來抑制炎癥反應的發(fā)生，從而降低免疫應激造成的炎癥損傷（包龍飛，2019）；鼠李糖乳桿菌GR-1 可通過介導MAPK信號通路調(diào)節(jié)大腸桿菌誘導的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞炎性損傷（劉佳瑋，2022）。

鼠李糖乳桿菌已被美國食品和藥物管理局授予“公認安全”地位，并被歐洲食品安全局列入“安全合格推定”名單，同時也是我國《可用于食品的菌種名單》之一。盡管有眾多的證據(jù)表明鼠李糖乳桿菌物種的總體安全性，但它們也可能造成不良反應（Chiang M C 等，2021）。因此，在使用乳酸桿菌前，需要進行菌株安全性評價。本研究以6 株鼠李糖乳桿菌為研究對象，進行溶血性、有害代謝產(chǎn)物產(chǎn)生、藥物敏感性、抑菌性能、小鼠急性毒性試驗，為乳酸桿菌株的進一步應用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鼠李糖乳桿菌BLCC2-0463、0465、0466、0467、0470、0479，由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物工程研究院菌種保藏中心提供。

1.1.2 試驗動物

昆明白鼠購買自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

硝酸鹽肉湯、氨基酸脫羧酶肉湯、蛋白胨水等生化管和血瓊脂平板、MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 試劑

紅霉素、氯霉素購買自中國食品藥品檢定研究院，克林霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素購買自中國獸藥監(jiān)察所，氨芐西林、鏈霉素購買自SIGMA，豬膽鹽購買自源葉生物，D- 乳酸試劑盒購買自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標儀（Tecan F50），瑞士Tecan 公 司； 超 凈 工 作 臺（SW-CJ-1F），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082），上海一恒科學儀器有限公司；雷磁pH 計（PHS-3D），上海儀電科學儀器股份有限公司；高速離心機（Thermo Fisher），賽默飛世爾科技公司。

2 實驗方法

2.1 乳桿菌的活化

取凍存菌種，接種至MRS斜面培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h 進行活化，反復活化兩次，放置4 ℃冰箱備用。

2.2 溶血性測定

參考Garcia（2017）的方法，將活化好的菌株使用無菌棉簽劃線接種至血瓊脂平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)48 h。長出的菌落周圍出現(xiàn)透明圈表示該菌株具有β-溶血性，可能具有致病性。

2.3 有害代謝產(chǎn)物的檢測

取活化菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～18h，備用。

使用D-乳酸試劑盒檢測乳桿菌發(fā)酵液D-乳酸的濃度。

取發(fā)酵液離心獲得菌體，用PBS 重懸，稀釋1000 倍，制成菌懸液待用；吸取50μL 菌懸液分別加入硝酸鹽肉湯、氨基酸脫羧酶對照、賴氨酸脫羧酶肉湯、鳥氨酸脫羧酶肉湯、蛋白胨水中，37 ℃培養(yǎng)。氨基酸脫羧酶試驗以鼠傷寒沙門氏菌作為對照。

2.4 抗生素敏感性的測定

依據(jù)美國臨床試驗室標準化委員會（M7-A 72006）以及國際標準化組織（ISO 10932/IDF223）發(fā)布的標準方法，選擇紅霉素、氯霉素、氨芐西林、克林霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、鏈霉素等進行菌株抗生素敏感性試驗。鼠李糖乳桿菌不同抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）如表1 所示（農(nóng)辦牧[2021]43 號）。

2.5 小鼠急性毒性試驗

調(diào)節(jié)鼠李糖乳桿菌菌懸液濃度為1×1010CFU/mL。選取70只健康雄性昆明雄鼠，隨機均分為7 組，試驗組小鼠每天灌服0.2 mL 活菌含量為1 ×1010CFU/mL 鼠李糖乳桿菌活菌液，對照組小鼠每天灌服等量的無菌生理鹽水；連續(xù)7 d，每天記錄小鼠生長情況，7 d 后剖解，觀察小鼠內(nèi)臟器官是否出現(xiàn)病變。

2.6 乳酸菌對指示菌抑菌活性的測定

將已活化的產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌菌懸液加入到已滅菌并冷卻至40～50 ℃的TSA 平板計數(shù)培養(yǎng)基中（使指示菌的濃度保持1×106CFU/mL），搖勻后迅速加入平板中，每平板15 mL。待平板凝固后，在平板上均勻打孔，孔徑7 mm，每孔分別加入各株試驗菌發(fā)酵液50μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑大小。

3 結(jié)果與討論

3.1 鼠李糖乳桿菌溶血性分析

溶血能力是乳酸菌屬安全性評價的重要篩選標準之一（李國花，2023）；微生物的溶血類型包括α-溶血、β-溶血、γ-溶血三種，其中α- 溶血（菌落周圍出現(xiàn)草綠色）和γ- 溶血（菌落周圍無草綠色無透明圈）均無致病性，僅β-溶血（菌落周圍出現(xiàn)透明圈）與致病性有關(guān)。

6 株鼠李糖乳桿菌在血瓊脂平板劃線培養(yǎng)48 h 均未產(chǎn)生溶血環(huán)，說明6 株鼠李糖乳桿菌不具有溶血活性，是較安全的菌株。

3.2 有害代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果

生物胺是世界范圍內(nèi)公認的影響人體健康的物質(zhì)（何一龍等，2020），因此，有必要對生物胺的產(chǎn)生進行研究。具有硝酸還原酶的菌株，能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，具有致癌風險，危害健康（凌宇恒等，2017）；色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)免疫功能，吲哚試驗可檢測菌株是否能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸（王夢姣等，2014）。本研究中6 株鼠李糖乳桿菌有害代謝產(chǎn)物結(jié)果見表2，精氨酸、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、硝酸鹽還原、吲哚試驗均為陰性，說明試驗菌株不會將賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸和精氨酸分解成尸胺、腐胺和精胺，不會將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚。乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的乳酸分為D-乳酸和L-乳酸，人體只具有代謝L- 乳酸的能力，過量的D-乳酸可能引起代謝紊亂甚至中毒（王夢姣等，2014）。試驗中的6 株乳桿菌均可產(chǎn)生少量的D-乳酸，D-乳酸含量均低于0.06μmol/mL，其中0479 產(chǎn)D-乳酸最少，為0.0395μmol/mL。

表2 有害代謝產(chǎn)物試驗結(jié)果

3.3 抗生素敏感性的測定

研究表明，細菌耐藥性基因能在微生物菌群間相互傳遞，而使某種病原菌獲得耐藥性，因此菌株耐藥性的安全問題受到極大關(guān)注。鼠李糖乳桿菌XX-11（鄒文政等，2020）對呋喃唑酮、磺胺甲唑與諾氟沙星有一定程度的耐藥性，而對青霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素與紅霉素等藥物表現(xiàn)敏感。何亞婷等（2015）從鯽魚分離出來的鼠李糖乳桿菌對四環(huán)素與紅霉素耐藥。本研究將試驗菌株MIC 值（見表3）與鼠李糖乳桿菌對不同抗生素的臨界值（見表1）對比，若試驗菌株MIC 值小于或等于臨界值為敏感；大于臨界值為不敏 感。結(jié) 果 顯 示，0463、0465、0479 對紅霉素、氯霉素、氨芐西林、克林霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、鏈霉素均表現(xiàn)出敏感性，0466 對氨芐西林耐藥，0467、0470 對氯霉素、氨芐西林耐藥，這表明不同鼠李糖乳桿菌對藥物的敏感性差異較大。

表3 菌株抗生素敏感性試驗結(jié)果

3.4 乳酸菌對指示菌抑菌活性的測定

有研究表明鼠李糖乳桿菌能產(chǎn)生對病原菌具有抑制作用的細菌素。鄒文政等（2020）研究表明，鼠李糖乳桿菌XX-11 培養(yǎng)上清液對大腸桿菌等10 株指示菌抑菌圈直徑在15 mm 以上；周鮮嬌（2014）等分離的7 株鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在2～3 cm。由表4 可以看出，本研究6株鼠李糖乳桿菌都對四種病原菌有一定的抑制作用，抑菌圈直徑在9.75 mm 以上，抑菌圈直徑小于文獻中的原因可能是試驗方法的差異造成的。

表4 抑菌性能結(jié)果

3.5 小鼠急性毒性試驗結(jié)果

觀察期間對照組與6 個試驗組小鼠均無異常表現(xiàn)、無死亡，精神狀態(tài)良好，糞便形態(tài)無明顯差異，體重正常增長，剖檢觀察未見任何器官、消化道病變，表明6 株鼠李糖乳桿菌對小鼠安全、無毒副作用。

4 結(jié)論

對實驗室保存的6 株鼠李糖乳桿菌進行溶血性、有害代謝產(chǎn)物、抗生素耐受性、小鼠安全性和抑菌性能試驗，試驗結(jié)果顯示，所選用的6 株鼠李糖乳桿菌均無溶血活性，不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶和吲哚，不能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，會產(chǎn)生少量的D-乳酸，均低于0.0600μmol/mL，其中0479 產(chǎn)D- 乳酸最少，為0.0395μmol/mL；0463、0465、0479菌株對所測試抗生素均敏感；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌圈直徑在9.75 mm 以上；對小鼠未造成不良反應。綜上所述，測試的6 株鼠李糖乳桿菌具有較強的安全性，且對常見腸道致病菌具有一定的抑制能力，具有較好的應用潛能。

參考文獻：（略）