三葉崖爬藤查耳酮異構酶基因克隆與外源誘導表達及酶活性分析

酈露群，龔一富*，宋奕珩，高孟雪，王何瑜

1.寧波大學海洋學院 浙江省海洋生物工程重點實驗室，浙江 寧波 315832

2.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315832

三葉崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg 是被子植物門雙子葉植物綱葡萄科崖爬藤屬多年蔓生植物，作為中國特有的珍貴中草藥，臨床上主要用于抗癌，治療血液及心腦血管疾病、肝炎、腦膜炎、肺炎、腸炎、咽炎等感染性疾病，以及兒童高熱驚厥[1-2]，在抗氧化、抗癌、抗炎等方面中也均得到證實[3-5]。三葉崖爬藤藥物有效成分分析方面已經有大量的研究報道，主要包括黃酮類、酚酸類、磷脂、糖酯類和苯磺酸類等[6]，黃酮類化合物是三葉崖爬藤的主要功效成分[7]，現有研究表明，其可結合新型冠狀病毒的2～3 個靶蛋白，從而發揮抗新冠病毒感染的作用[8]。

已有研究闡述黃酮類化合物的合成通路中的關鍵酶基因，查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）基因調控早期黃酮生物合成途徑，并產生不同種類的類黃酮前體[9]。CHI基因作為黃酮合成過程中重要的限速酶，催化查耳酮異構化為黃烷酮柚皮素。CHI基因具有重要作用，可以控制花色苷的合成，增強植物抗逆性和抗氧化能力，增加藥用植物中的黃酮及類黃酮化合物的積累等[10]。現已從苦蕎麥Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.[11]、灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.[12]、青蒿ArtemisiacaruifoliaBuch.-Ham.ex Roxb.[13]、紅花CarthamustinctoriusL.[14]和丹參SalviamiltiorrhizaBunge.[15]等多種藥用植物中克隆得到了CHI基因序列并對其功能進行剖析，但在三葉崖爬藤中CHI基因還未見有被克隆的研究報道，因此從三葉崖爬藤中克隆CHI基因并探究基因表達特性可為三葉崖爬藤黃酮生物合成機制提供分子基礎。

外源誘導因素對次生代謝產物的形成具有重要作用，黃酮類合成途徑的眾多結構基因和調控基因均具有誘導表達特性，已有研究表明，吲哚-3-乙酸（3-indoleacetic acid，IAA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）和酵母提取物（yeast extract，YE）均可誘導藥用植物中次生代謝產物的生物合成。100 μg/mL 的IAA 可以促進甘草中甘草酸的積累[16]。100 μmol/L 的MeJA 處理可以誘導丹參中苯丙烷生物合成基因的表達，促進酚類化合物的積累[17]。ABA 可促進越南三七中三萜皂苷的積累[18]。100 μmol/L 的SA 可有效提高東北刺人參不定根中黃酮類和蒽醌類物質的含量[19]。100 mg/L 的YE可誘導夾竹桃科植物懸浮細胞總黃酮和總酚的積累[20]。外源化學誘導子均可誘導處理參與黃酮類生物合成途徑的代謝和相關基因的表達，但在三葉崖爬藤中對于誘導子調控次生代謝產物合成的研究較少，主要針對各種培養條件下三葉崖爬藤生理生化和黃酮含量方面，對關鍵基因表達調控的研究較少。目前對于黃酮合成研究主要集中在相關酶基因的表達或相關酶活性的變化，缺乏對基因表達、酶活性和黃酮含量三者之間的研究。本研究從基因層面出發，重點探討外源誘導子調控CHI基因表達、CHI酶活性及黃酮含量積累的機制。本研究從三葉崖爬藤中克隆CHI基因并進行生物信息學分析，測定三葉崖爬藤中各組織CHI基因表達量及黃酮含量，并分析各組織基因表達量與黃酮含量之間的相關性。探究IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 對三葉崖爬藤CHI基因相對表達量和CHI 酶活性的動態變化及黃酮含量的影響，并對黃酮含量、CHI基因表達量和CHI 酶活性進行相關性分析。明確三葉崖爬藤黃酮合成相關酶基因CHI在不同組織和不同誘導處理下的表達模式，以期進一步探究三葉崖爬藤中CHI基因功能及外源誘導子提高三葉崖爬藤內源性黃酮含量的機制。

1 材料與儀器

1.1 材料

三葉崖爬藤由寧波大學海洋學院海洋生物工程重點實驗室提供，由寧波大學海洋學院龔一富副教授鑒定為三葉崖爬藤T.hemsleyanumDiels et Gilg。部分樣品烘干用于黃酮含量測定，部分樣品液氮速凍后保存于?80 ℃低溫條件下，用于RNA 提取。

蘆丁對照品（批號1103M028，質量分數≥98%）、IAA（批號610M021）、MeJA（批號3230306002）、ABA（批號814C0223）、SA（批號515A031）和YE（批號505U051）購于北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、三氯化鋁和氫氧化鈉購于國藥集團化學試劑有限公司；克隆載體pMD-19T、大腸桿菌感受態細胞DH5α 購于寶日醫生物技術（北京）有限公司；2×Taq MasterMix 購于江蘇康為世紀生物科技股份有限公司，植物總RNA 提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒購于美國Omega Bio-Tek 公司；反轉錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；CHI 試劑盒購于蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 儀器

光照培養箱（寧波萊福科技有限公司）；PCR 擴增儀（eppendorf 公司，德國）；實時熒光定量PCR儀（eppendorf 公司，德國）；NanoDrop 2000 核酸/蛋白定量儀（Thermo 公司，美國）；高速冷凍離心機（eppendorf 公司，德國）。

2 方法

2.1 三葉崖爬藤的處理與采集

選擇生長狀況良好且相似的三葉崖爬藤植株，每組每株葉片噴施5 mL 蒸餾水、IAA、MeJA、ABA、SA 和YE，2 周后取樣，55 ℃烘干，用于測定黃酮含量變化。另外在同等培養和處理條件下，采集處理后0、6、12、24、48、72、96 h 外源誘導條件下的三葉崖爬藤葉片組織用于基因表達量及酶活性的測定。所有樣品采集均遵循3 個生物學重復原則并在采集后立即液氮速凍儲存在?80 ℃低溫條件下，用于進一步的實驗分析。

2.2 三葉崖爬藤轉錄組測序及CHI 基因序列的獲得

提取三葉崖爬藤葉片總RNA，測定RNA 濃度，并對提取的總RNA 進行電泳檢測評估。通過RTPCR，反轉錄為cDNA，并對文庫進行構建、純化、檢測、定量，送至安升達生物科技有限公司進行Illumina HiSeqTM2000 高通量測序。通過數據分析獲得三葉崖爬藤CHI基因的cDNA 全長序列，利用Primer 5.0 設計了一對CHI基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）擴增引物：F：5’-TTCTCCTTTATCTGCATCAG-3’；R：5’-GCACAAGGGTTTTATTCCAT-3’。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR 后電泳檢測、回收，通過測序證實插入片段。

2.3 三葉崖爬藤CHI 蛋白的生物信息學分析

在DNAMAN 9.0 軟件上分析三葉崖爬藤CHI基因cDNA 全長序列，通過ExPASy Protparam 預測蛋白質基本理化性質，包括氨基酸數目、相對分子質量、PI 值、分子式和不穩定系數等。WOLF PSORT進行蛋白質亞細胞定位的預測。ExPASy ProtScale預測蛋白親水性和疏水性。TMHMM 2.0 分析蛋白質跨膜結構。SignalP 4.1 Server 進行信號肽預測。SMART 和NCBI 中的CD search 分析蛋白質結構域。SOPMA 對CHI 蛋白的二級結構進行預測。SWISS-MODEL 和Phyre2 預測CHI 蛋白三級結構。通過NCBI 基因數據庫，下載綠豆、甘草、苜蓿和黃芪等15 個物種的CHI 氨基酸序列并利用MEGA 11 以鄰接法（neighbour joining，NJ），設置Bootstrap值（自展值）為1 000，其他參數默認，進行序列比對并構建系統進化樹。

2.4 三葉崖爬藤黃酮含量測定

黃酮含量測定參考朱良輝等[21]的方法，以蘆丁對照品的濃度（Y）為橫坐標，吸光度值（X）為縱坐標，繪制線性方程Y＝9.340 7X－0.004 5，R2＝0.998 8，線性范圍為0.008～0.048 mg/mL，用于計算三葉崖爬藤黃酮含量。本研究所建立的黃酮含量測定方法能滿足方法學考察要求。

2.5 三葉崖爬藤CHI 基因組織及誘導表達測定

分別提取三葉崖爬藤根、莖、塊莖、老葉和幼葉組織總RNA。利用IAA、MeJA、ABA、SA 和YE誘導處理三葉崖爬藤，分別提取經誘導處理0、6、12、24、48、72、96 h 后的三葉崖爬藤葉片RNA，測定三葉崖爬藤中各組織及各誘導處理的RNA 濃度，并對提取的總RNA 進行電泳檢測評估，反轉錄為cDNA，并于?20 ℃保存備用。設計qRT-PCR 引物F-5’-GCCAACCACCTCTTCCTCAG-3’和R-5’-TCAACAGTCTTGCCCTTCCA-3’。以GAPDH基因作為內參基因，設計引物序列為F-5’CCATTACTGCTACCCAAAAAACT-3’和 R-5’-GTGAGGTCAACCACCGACACATC-3’。根據上述基因的引物序列進行RT-qPCR 擴增，對三葉崖爬藤CHI基因進行各組織及各誘導處理的表達量分析，各組織基因表達量以塊莖中的表達量為參照。qRT-PCR 反應體系為：滅菌水8.2 μL，SYBR qPCR Master Mix10 μL，正反引物各0.4 μL，cDNA 模板1.0 μL，共20 μL 的反應體系。qRT-PCR 反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，熔解曲線按儀器默認，反應40 個循環。采用2?ΔΔCt法分析基因表達水平。

2.6 誘導條件下三葉崖爬藤CHI 酶活性測定

CHI 酶活性測定使用查耳酮異構酶試劑盒，稱取三葉崖爬藤誘導處理后的葉片0.1 g 和提取液1 mL 于離心管中，至于冰上，進行冰浴勻漿，4 ℃離心取上清，置冰上待測。用蒸餾水調零，在1 mL 玻璃比色皿中加入50 μL 上清液和950 μL緩沖液，立即混勻并在381 nm 下測定初始吸光度（A）值，記為A1，37 ℃保溫30 min 后測定A值，記為A2，計算ΔA（ΔA＝A2－A1）。按公式計算CHI活性。

CHI 活性＝400×ΔA/樣本質量

2.7 數據分析

試驗所得數據采用Excel 2016、SPSS 26.0 和Graph Pad Prism 9 等軟件進行處理。

3 結果與分析

3.1 三葉崖爬藤CHI 基因克隆和序列分析

經轉錄組測序分析獲得三葉崖爬藤CHI基因cDNA 全長序列1 096 bp，經ORF-Finder 分析，含有一個長為714 bp 的開放閱讀框，編碼237 個氨基酸（圖1）。對三葉崖爬藤CHI 蛋白進行預測，該蛋白分子式為C1148H1819N285O348S5，PI 值為5.28，偏酸性，相對分子質量為25 340，其中谷氨酸（Glu）和絲氨酸（Ser）占比最高，達10.1%，色氨酸（Trp）和組氨酸（His）占比最低，只占0.8%。該蛋白不存在信號肽，為非分泌型蛋白，編碼的氨基酸全都在膜外，不具有跨膜結構。ProtScale 預測該蛋白為疏水性蛋白，且總平均疏水指數（GRAVY）為0.070。亞細胞定位預測三葉崖爬藤CHI蛋白主要分布在在葉綠體中，其次分布于細胞質中，蛋白不穩定系數為37.61，屬于穩定蛋白。結構域預測結果表明，三葉崖爬藤CHI 蛋白屬于Chalcone-3 超基因家族，包含一個Chalcone 結構域（4～233），編碼查耳酮黃烷酮異構酶。二級結構預測結果表明，4 種二級結構在整個氨基酸序列中均有分布，該蛋白中α-螺旋（alpha helix）占比最高，占46.41%，無規則卷曲（random coil）占29.11%，延伸鏈（extended strand）占16.03%，β-折疊（beta turn）占8.44%。α-螺旋為三葉崖爬藤CHI 蛋白二級結構的主要結構組成元件，占比最高，其次是延伸鏈。利用Phyre2和SWISSMODEL 在線預測三葉崖爬藤CHI 編碼蛋白三級結構空間結構（圖2）。在蛋白三級結構中，三葉崖爬藤CHI 蛋白呈明顯的倒置三明治狀折疊結構，是該類蛋白的特征之一，明顯可見三級結構中存在大量的α-螺旋和無規則卷曲，與二級結構預測結果一致。

圖2 三葉崖爬藤CHI 蛋白的三維空間結構Fig.2 Three-dimensional spatial structure of T.hemsleyanum CHI protein

3.2 三葉崖爬藤CHI 蛋白序列比對和系統進化樹分析

為進一步研究三葉崖爬藤CHI氨基酸序列與其他物種之間的進化關系，利用MEGA11 中的NJ 法構建系統進化樹（圖3）。進化樹總體分為2 個分支，單子葉植物和雙子葉植物分支。美人蕉、玉米、日本晴水稻和小麥聚為單子葉植物分支，綠豆、甘草、苜蓿、黃芪、花生、大豆和歐洲葡萄等聚為雙子葉植物分支，雙子葉植物分支可進一步細分為豆科和葡萄科兩小支，三葉崖爬藤CHI 蛋白與其他葡萄科植物CHI 蛋白具有高度的相似性，與歐洲葡萄VitisviniferaL.和山葡萄VitisamurensisRupr.在系統進化樹上聚為葡萄科小支，同源性最高，說明該基因具有較高的科間同源性。

圖3 三葉崖爬藤CHI 蛋白與其他植物CHI 蛋白系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of T.hemsleyanum CHI proteins and other plant species

3.3 三葉崖爬藤CHI 基因組織表達分析

利用qRT-PCR 測定三葉崖爬藤CHI基因在不同組織下的表達模式，結果表明（圖4），CHI基因在三葉崖爬藤各組織中均得到表達，但基因表達量存在差異。以三葉崖爬藤塊莖中的CHI基因表達量為參照，表達量從高到低為根＞幼葉＞莖＞老葉＞塊莖，CHI基因在根中的表達量顯著高于其他組織，是幼葉、莖、老葉和塊莖的1.52、2.44、2.61、4.78倍。黃酮含量測定結果表明，三葉崖爬藤各組織黃酮含量從高到低為莖＞根＞塊莖＞幼葉＞老葉（圖4）。CHI基因在三葉崖爬藤根、幼葉、老葉中表達量與總黃酮量變化趨勢一致，莖和塊莖中基因表達量與總黃酮含量趨勢不一致，對2 組數據進行相關性分析，結果表明，各組織中基因表達量與總黃酮含量趨勢無顯著相關性。

圖4 三葉崖爬藤在各組織中的黃酮含量和CHI 基因表達量Fig.4 Flavonoid content and CHI gene expression of T.hemsleyanum in various tissues

3.4 三葉崖爬藤CHI 基因誘導表達調控分析

利用IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 誘導處理三葉崖爬藤葉片，利用RT-qPCR 對不同處理時間后CHI基因表達量進行檢測，結果表明，5 種外源誘導物質對三葉崖爬藤CHI基因表達量均起到不同程度的誘導作用。IAA 處理后，三葉崖爬藤CHI基因在96 h 相對表達量達到峰值，基因表達量為對照組的7.36 倍（圖5-A）。MeJA 處理后，三葉崖爬藤CHI基因表達量隨著處理時間的增加，基因表達量呈逐漸上升的變化趨勢，48 h 后基因表達量開始顯著高于對照組，96 h 基因表達量達到最高，為對照組的11.61 倍，說明MeJA 對CHI基因誘導表達效果顯著且相對較快（圖5-B）。ABA 處理后，CHI基因表達量呈現先穩定后迅速提高的趨勢，在72 h 和96 h 顯著提高了三葉崖爬藤CHI基因表達量，在處理后72 h 達到最高，為對照組的5.04 倍（圖5-C）。SA、YE 處理后，三葉崖爬藤CHI基因表達量也呈現先穩定后迅速提高的趨勢，均在96 h 顯著提高了三葉崖爬藤CHI基因表達量，相比對照組分別提高了8.62 倍和5.71 倍（圖5-D、5-E）。結果表明，5 種外源物質對三葉崖爬藤CHI基因表達有重要的誘導提高作用。

為進一步探究5 種外源誘導處理下三葉崖爬藤黃酮含量積累情況，對各誘導處理下的三葉崖爬藤黃酮含量進行測定。結果表明，ABA 處理對黃酮積累效果最為明顯，相比對照組提高了1.97 倍，其次是YE 和SA，相比對照組提高了1.74 倍和1.57 倍，最后是MeJA 和IAA 比對照組提高了1.42 倍和1.31倍（圖5-F）。利用不同誘導物質處理后，對三葉崖爬藤黃酮含量的影響雖具有一定差異性，但較對照組黃酮含量均顯著提高。結果表明，5 種外源物質均促進三葉崖爬藤黃酮含量積累。

3.5 不同誘導處理對CHI 酶活性的影響分析

為進一步探究5 種外源誘導物質在翻譯水平上對黃酮含量積累的作用，對各誘導處理下三葉崖爬藤CHI 酶活性進行測定，結果表明，IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 處理下CHI 酶活性與對照組相比顯著提高（圖6）。IAA 處理后，0～48 h CHI 酶活性無顯著差異，處理后72 h，CHI 酶活性才顯著提高，96 h 達到最高，相比對照組提高了3.23 倍（圖6-A）。MeJA 處理后，0～72 h 酶活性基本持平，只在處理后96 h 顯著提高，相比對照組提高了1.76 倍（圖6-B）。ABA 處理后，0～48 h CHI 酶活性基本無變化，72 h 后CHI 酶活性才顯著提高，96 h 達到最高，相比對照組提高2.41 倍（圖6-C）。SA 和YE在處理后0～24 h 酶活性都無顯著差異，48 h 開始顯著提高，在96 h 后酶活性進一步提高，相比對照組分別提高了2.39 倍和2.95 倍（圖6-D、6-E）。該5 種誘導物質對CHI 酶活性均有不同程度的促進作用，結合黃酮含量積累結果，進一步說明外源物質誘導提高了CHI 酶的活性，加速了次生代謝產物黃酮的合成。

圖6 5 種外源因素 [IAA (A)、MeJA (B)、ABA (C)、SA(D)、YE(E)] 對三葉崖爬藤CHI 酶活性的影響Fig.6 Effect of five exogenous factors [IAA (A), MeJA (B), ABA (C), SA(D), YE(E)] on CHI enzyme activity of T.hemsleyanum

3.6 三葉崖爬藤黃酮含量、CHI 基因表達量和CHI酶活性的相關性

利用SPSS 26.0 進行一元線性回歸分析，結果表明，5 種外源誘導處理雖然在黃酮合成途徑中對黃酮的積累及CHI基因的表達有顯著促進作用，但在各誘導處理下，黃酮含量與CHI基因表達量之間未表現出明顯的相關性，黃酮含量與CHI 酶活性的相關系數要高于CHI基因表達（R2＝0.453，P＜0.01），說明黃酮含量與CHI 酶活性存在中等相關，在各誘導處理下，CHI 酶活性變化顯著影響黃酮含量。

4 討論

藥用植物三葉崖爬藤用途廣泛，市場需求量大，其中含有的黃酮類化合物具有抗癌、抗炎等多種不同的藥理作用，提高三葉崖爬藤內源性黃酮含量尤為重要。CHI是黃酮合成途徑的關鍵基因之一，具有重要的作用，它調控早期黃酮類合成途徑，提高CHI 酶活性，可以提高植物中黃酮類、花色素等有效成分的含量[22]。本研究基于前期三葉崖爬藤轉錄組數據，結果表明，三葉崖爬藤CHI基因全長1 096 bp，含有一個長為714 bp 的開放閱讀框，編碼的237 個氨基酸，通過測定三葉崖爬藤根、莖、塊莖、老葉、幼葉的黃酮含量及黃酮合成途徑關鍵酶基因CHI的表達量，探究黃酮含量和CHI基因表達差異及其關系。CHI基因在三葉崖爬藤各組織中均有表達，以三葉崖爬藤塊莖中CHI基因表達量為參照，表達量從高到低為根＞幼葉＞莖＞老葉＞塊莖，說明CHI基因在不同部位的時空表達特性不同，各組織總黃酮含量從高到低為莖＞根＞塊莖＞幼葉＞老葉，不同部位總黃酮含量存在著明顯差異，這與前人的實驗結果相符[23]，同時也證明三葉崖爬藤全草均可入藥一說。三葉崖爬藤各組織中CHI基因表達與黃酮含量并無顯著相關性，說明黃酮含量與三葉崖爬藤CHI基因的表達具有差異性，推測自然狀態下三葉崖爬藤黃酮含量積累不完全只受到CHI基因表達量的影響，還受到黃酮類合成途徑中其他重要的限速酶影響，說明黃酮類生物合成途徑是復雜多變的，其分子機制有待進一步研究。另外，各類非生物脅迫因素也是黃酮生物合成和積累的調節劑，如植物激素尤其是生長素或其他外源誘導物質可以調控黃酮類化合物合成途徑和有效成分的積累[24-26]。

本研究利用IAA、MeJA、ABA、SA 和YE 誘導處理三葉崖爬藤，結果表明，CHI基因表達量和黃酮含量均表現出不同程度的上調，其他物種的CHI基因也受到本實驗中5 種外源誘導物質的誘導表達，IAA 誘導草莓FragariaananassaDuch.CHI的表達，從而使總黃酮、總酚、花色苷的含量得到積累[27]。外源添加MeJA 不僅增強了黃芩Scutellaria baicalensisCHI基因表達，而且使黃岑產生更多的黃芩苷、黃芩素等黃酮化合物[28]，植物激素ABA、SA 誘導愈傷組織中白香木AquilariasinensisCHI基因表達，從而積累了內源黃酮類化合物[29]。YE 可以誘導甘草GlycyrrhizauralensisFisch.毛狀根中CHI基因表達，使CHI的轉錄水平和CHI 酶活性顯著提高，從而積累甘草毛狀根中的黃酮含量[30]。研究成果表明，CHI基因表達量、CHI 酶活性、黃酮含量受到本實驗5 種外源物質不同程度的誘導，說明外源誘導物質對三葉崖爬藤CHI基因響應和黃酮代謝具有重要作用。究其原因，一方面，這些外源誘導物質作為信號轉導分子誘導三葉崖爬藤CHI基因轉錄水平的上調，另一方面，在翻譯水平上，三葉崖爬藤CHI 酶活性水平得以提高，從而產生并積累大量的次生代謝產物。

不同誘導物質下三葉崖爬藤黃酮含量和CHI基因表達量的相關性分析發現，5 種誘導處理下，黃酮含量與CHI基因表達量并無顯著相關性，在枸杞中，CHI基因表達量與類黃酮含量無顯著相關關系，而CHI 酶活性與類黃酮含量達到顯著相關關系[31]，這與本實驗結果相符。說明黃酮合成途徑錯綜復雜，CHI基因作為黃酮合成途徑上游基因，對最終代謝產物的積累不起決定性作用，也可能還受到其他轉錄調控因子的影響，其機制有待進一步研究。

不同誘導物質下三葉崖爬藤黃酮含量和CHI酶活性的相關性分析發現，黃酮含量與CHI 酶活性存在顯著正相關。在煙草中CHI 酶活性與黃酮含量呈顯著正相關關系[32]，這與本實驗結果相符。說明5種外源處理可以強烈激活CHI 酶的活性，促使產物黃酮生成與積累，并且隨著處理時間的延長，其活性整體呈逐漸上升的趨勢，CHI 作為關鍵酶參與到了黃酮合成途徑中。外源物質的誘導、關鍵酶基因的表達、生物合成關鍵酶活性的變化以及次生代謝產物的產生與積累之間存在相互交織的關系。因此，通過外源誘導物質提高關鍵酶基因的表達及酶活性的提高是藥用有效成分積累的方法之一。外源誘導物質可能通過多方面影響黃酮合成通路關鍵基因，因此可通過轉錄組測序分析對各關鍵基因調控黃酮合成的機制進行更進一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突