基于網絡藥理學整合體內實驗探究四物湯單味藥組分治療膽汁淤積性肝損傷的作用與機制

汪 樂，李佳楠，楊 洋，曲姣蓉*，李曉驕陽*

1.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 100029

2.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029

膽汁淤積性肝損傷（cholestatic liver injury，CLI）是一種臨床常見的肝臟損傷，以原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）和原發性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）較為常見，其主要特征是由于膽汁的形成、分泌或排泄過程出現障礙，導致膽汁不能正常流向腸道，而在肝臟或膽道系統內積聚并引起臟器損傷和肝纖維化。這種疾病可以由多種原因引起，包括膽道梗阻、肝內膽管損傷遺傳因素、肝膽系統結構異常、藥物毒性、感染、肝自身免疫疾病等[1]。熊去氧膽酸是大多數CLI 的基礎治療藥物，但它仍無法阻止部分PBC 以及PSC 患者的疾病進展，最終可能導致肝功能失代償，需要進行肝移植治療。一些新型抗膽汁淤積劑如核受體激動劑、利膽劑和膽汁酸合成抑制劑，可能會在一定程度上改善CLI 及其相關并發癥，但目前仍缺乏有效臨床證據[2-3]。因此，未來研究可致力于改變膽汁淤積、炎癥、細胞存活以及改善纖維化等多個途徑共同改善CLI[4]，尋找相關全新治療策略勢在必行。

中醫藥以其一方多藥、一藥多成分的特點或許能為CLI 更全面的治療提供新的研究方向。四物湯最早見于晚唐時期藺道人所著的《仙授理傷續斷秘方》，被用于外傷引起的瘀血和疼痛。隨著研究的不斷深入，四物湯逐漸在中醫臨床中得到廣泛應用，并被認為是一種補血、活血、調經的經典方藥，其核心成分包括當歸、川芎、白芍、熟地黃4 味藥。作為補血調經的基礎方劑，四物湯享有“婦科第一方”的美譽，有研究報道其通過提高抗氧化能力、調節血管生成來改善小鼠卵巢功能[5-6]。此外，還有研究報道四物湯通過抑制腫瘤細胞轉化產生的抑癌作用[7-8]。近年來，大量實驗研究發現，四物湯可通過調控機體免疫微環境、修復膽酸代謝穩態等途徑有效改善因手術介入或化學藥損傷導致的包括CLI在內的多種慢性肝病[9-11]。四物湯以其補益氣血功效，或益于改善肝臟組織的養分供應，從而改善CLI。方中川芎入肝、膽經，具有活血化瘀、祛風止痛的功效；白芍則能養血斂陰、揉肝止痛；熟地味厚滋膩、滋補營血；當歸補血和血，4 藥合用，血虛得補，血滯得散[12]。盡管大量文獻已報道四物湯及其中分離所得多種活性成分（如川芎嗪、阿魏酸、芍藥苷等）均可有效緩解CLI，然而目前尚未有研究對于4 種單味藥的藥效進行對比評估，因此篩選單味藥及主要活性成分有助于進一步探究四物湯改善慢性肝病的作用與機制。

網絡藥理學在中醫藥領域的應用是一種整合計算機科學、網絡科學和藥理學的交叉學科研究方法。它主要通過大數據、網絡分析和計算模型等技術手段，系統地研究中醫藥的藥理學特性、作用機制、多成分相互作用等方面。網絡藥理學可以幫助揭示中醫藥中各成分的作用靶點，以及這些靶點之間的相互關系，從而更全面地理解中醫藥的藥理學特性[13]。前期有研究報道過四物湯復方的網絡藥理學，但本研究采用單味藥的網絡藥理學，對比四物湯中各單味藥的作用靶點。同時結合動物實驗對四物湯中的單味藥川芎、白芍、當歸、熟地黃治療CLI的藥效及靶點進行驗證，探討了四物湯治療CLI 的作用機制，對進一步解釋四物湯治療肝膽疾病的科學內涵、臨床應用以及挖掘四物湯中有效活性成分具有重要意義。

1 材料

1.1 動物

SPF 級C57BL/6J 小鼠，8 周齡，雌雄各半，體質量22～24 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心，在正常條件下飼養，周期為12 h 光照/12 h 黑暗，提供無限量飼料和純水。動物實驗經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號BUCM-4-20200730023160）。

1.2 藥材

川芎、熟地黃、白芍、當歸飲片均購自北京同仁堂（集團）有限公司，經北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理教研室劉閏平教授分別鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖、玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根的炮制加工品、毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根。

1.3 藥品與試劑

丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號20231013）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號20230802）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號20230802）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒（批號20230921）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（批號20231012）、總膽紅素（total bilirubin，T-BIL）試劑盒（批號20230817）均購自南京建成生物工程研究所；異氟烷（批號20230502）購自江蘇恒豐強生物技術有限公司；無水乙醇（批號20231018）、異丙醇（批號20220801315）均購自北京正程生物科技有限公司。

1.4 儀器

R500 型麻醉機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；酶標儀（賽爾福醫療科技北京有限公司）；C1000 Touch 型PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；Centrisart?D-16C 型離心機（德國賽多利斯公司）；孵育箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；F6/10型勻漿儀（上海凈信實業發展有限公司）；Nano-800+型超微量核酸蛋白測定儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

2 方法

2.1 四物湯單味藥活性成分及靶點基因的獲取

分別以川芎、白芍、熟地黃、當歸為關鍵詞在TCMSP 數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）進行檢索，獲取各單味藥的相關活性成分及靶點。將檢索后得到的活性成分以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[14]為納入標準對藥物入血成分進行篩選，得到其潛在活性成分及對應靶點信息。將篩選后得到成分及靶點信息整合匯總并去掉重復靶點后，將靶點蛋白名依次輸入UniProt 數據庫中得到標準基因名稱并匯總。

2.2 CLI 靶點的獲取

以CLI 標準英文名稱“cholestatic liver injury”為檢索詞在GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫中進行檢索，得到CLI 相關疾病靶點。并剔除在UniProt 數據庫中無對應ID 號的靶點，保留有對應標準基因名及ID 號的靶點并進行匯總。

2.3 “藥物-成分-作用靶點”網絡構建及“藥物-疾病”交集靶點獲取

運用Cyctoscape 3.10.1 軟件將“2.1”項下收集得到的活性成分及其相對應的靶點基因進行可視化處理，分別構建川芎、白芍、熟地黃、當歸的“藥物-活性成分-作用靶點”網絡。將上述所獲取的各單味中藥的作用靶點分別和疾病靶點導入生物信息學與進化基因組學（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）網站中，即可得到川芎、白芍、熟地黃、當歸與CLI 之間的交集靶點，并據此繪制韋恩圖。

2.4 生物信息學分析

根據韋恩圖的結果，將起主要治療作用的單味藥物靶點基因數據導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/ ），將物種設置為“Mus musculus”，進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，根據P值從小到大，篩選出藥物作用靶點的主要生物過程及信號通路，GO 分析取前10 位、KEGG 分析取前20 位結果。并對數據進行可視化處理，利用微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn/）在線繪制GO 分析條形圖及KEGG 富集分析氣泡圖，用于后續分析及實驗驗證。

2.5 四物湯各單味藥水提物的制備

分別稱取川芎、白芍、熟地黃、當歸飲片各20 g，打碎成粉末狀后裝入藥包，加入200 mL 水，在圓底燒瓶中浸泡1 h，之后的操作根據各藥物性質的不同時間長短有所不同，其中川芎加熱回流1.5 h，濾過，藥渣以同樣的方法再煮1.5 h 并濾過[15]；白芍加熱回流2 h，濾過，藥渣以同樣的方法再煮1.5 h并濾過[16]；熟地黃、當歸加熱回流30 min，濾過，藥渣以同樣的方法再煮20 min 并濾過[17-18]。將2 次濾過后藥液混合后進行抽濾，所得液體通過旋蒸儀濃縮至50～100 mL，收集濃縮藥液，取部分應用HPLC 測定并采取外標法測定熟地黃水提物中5-羥甲基糠醛質量濃度為5.07 mg/mL、白芍水提物中氧化芍藥苷質量濃度為4.09 mg/mL、當歸水提物中阿魏酸質量濃度為1.6 mg/mL、川芎水提物中洋川芎內酯A 質量濃度為2.2 mg/mL。其余藥液室溫冷卻后放置?80 ℃冷凍過夜，次日轉移至冷凍干燥機，直至凍干至粉末狀，收集水提物粉末待用。

2.6 動物實驗

2.6.1 分組、造模與給藥 采用隨機分組法將C57BL/6J 小鼠分成假手術組、模型組、川芎水提物組、白芍水提物組、熟地黃水提物組和當歸水提物組，每組8 只（雌雄各4 只）。除假手術組外，其余各組均進行膽總管結扎（bile duct ligation，BDL）手術。小鼠仰臥位固定于手術操作臺，持續異氟烷氣體麻醉，將小鼠腹部毛發剔除，用醫用碘伏和75%乙醇交替消毒，在會陰上1 cm 處剪開皮膚，開口至劍突下1 cm 左右，逐層分離皮下筋膜及肌肉層，暴露腹腔臟器，并使用撐開器將兩側組織持續撐開，用沾有PBS 溶液的無菌棉簽將小鼠的肝臟和胃腸朝上下不同方向撥開，分離膽總管，用5-0 手術縫合線結扎膽總管，結束后由內向外逐層縫合各層組織。假手術組同樣進行腹部組織切開及縫合，但不對膽總管進行結扎。參考文獻報道[19]選擇最佳的水提物治療劑量（50 mg/kg），各給藥組ig 相應藥物，術前3 d 開始預給藥，術后恢復2 d 后繼續給藥4 d。

2.6.2 血清樣品的采集與處理 使用烏拉坦（1.4 g/kg）ip 麻醉成功后，從小鼠下腔靜脈采集血樣，常溫放置30 min，待其凝固后，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，取上清，置于1.5 mL EP 管中，即為血清樣品。取部分血清稀釋5 倍，用于血清生化指標檢測，其余放置于?80 ℃冰箱儲存。

2.6.3 肝臟組織病理變化觀察 取血后，小鼠脫頸椎處死，解剖分離肝臟。取部分肝臟組織經福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后進行連續切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，在超分辨顯微組織成像系統下觀察病理學變化。

2.6.4 肝損傷指標檢測 參照試劑盒說明書檢測小鼠血清中ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL 含量，同時檢測肝組織中HYP 水平。

2.6.5 肝組織基因表達檢測 各組取部分肝臟組織，按照試劑盒說明書提取總RNA 并合成cDNA，進行qRT-PCR 分析。肌動蛋白2（actin alpha 2，Acta2）、I 型膠原α 1 鏈（collagen type I alpha 1 chain，Col1a1）、基質金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，Timp1）、基質金屬肽酶12（matrix metallopeptidase 12，Mmp12）、Mmp13、Mmp14、核受體亞家族3C 組成員2（nuclear receptor subfamily 3 group C member 2，Nr3c2）、類視黃醇X受體（retinoid X receptor alpha，Rxra）、前列腺素內過氧化物合成酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2）、血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule 1，Vcam1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，Tnf）、有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 8，Mapk8）、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT serine/threonine kinase 1，Akt1）、激酶插入結構域受體（kinase insert domain receptor，Kdr）、Mapk14、次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶 1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，Hprt1）引物序列見表1，以Hprt1作為內參。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.7 統計學分析

使用GraphPad Prism 8 軟件對實驗數據進行處理及分析，結果以±s表示，組間采用單因素方差（One-way ANOVA）分析。

3 結果

3.1 四物湯各單味藥活性成分及靶點的獲取、CLI相關靶點的獲取

通過TCMSP 數據庫分別對川芎、白芍、當歸、熟地黃活性成分的檢索，以及根據設定好的納入標準OB≥30%及DL≥0.18 進行篩查，共得到川芎的6 個活性成分和30 個藥物作用靶點，白芍共獲取7個活性成分以及90 個藥物作用靶點，熟地黃僅獲取2 個活性成分和31 個藥物作用靶點，當歸僅獲取2 個活性成分但包含52 個藥物靶點（活性成分見表2）。根據獲得的數據使用Cyctoscape 3.10.1 軟件分別繪制川芎、白芍、當歸、熟地黃的“藥物-活性成分-作用靶點”網絡（圖1）。通過對Genecards數據庫的檢索，共獲得CLI 的843 個相關靶點，剔除在UniProt 數據庫中無對應ID 號及標準基因名的靶點，最終得到753 個疾病靶點。結果顯示川芎與白芍活性成分較多，白芍與當歸的作用靶點較多，熟地黃的活性成分及作用靶點均較少。從網絡藥理學的角度分析，川芎、白芍、當歸的藥理作用相對廣泛，而熟地黃的藥理作用相對局限。

圖1 川芎 (A)、白芍 (B)、熟地黃 (C)、當歸 (D) 活性成分及作用靶點網絡Fig.1 Network of active ingredients and targets of Chuanxiong Rhizoma (A), Paeoniae Radix Alba (B), Rehmanniae Radix Praeparata (C) and Angelicae Sinensis Radix (D)

表2 納入網絡藥理學4 種單味藥中的活性成分Table 2 Active ingredients included in four individual herbs in network pharmacology

3.2 川芎、白芍、當歸、熟地黃與CLI 交集靶點的獲取

將各單味藥獲取的靶點基因與CLI 靶點基因分別導入生物信息學與進化基因組學網站，得到川芎與CLI 的14 個交集靶點、白芍與CLI 的37 個交集靶點、當歸與CLI 的15 個交集靶點、熟地黃與CLI的5 個交集靶點。并據此結果分別繪制韋恩圖（圖2）。結果顯示，川芎、白芍、當歸、熟地黃分別有46.7%、41.1%、28.8%、16.1%的靶點基因可作用于CLI。因此，推測4 味藥均能作用于CLI，但川芎、白芍對CLI 療效的特異性明顯高于當歸、熟地黃。

3.3 基于體內CLI 模型驗證4 種單味藥藥效及其中關鍵單味藥的藥效機制

上述網絡藥理學結果表明，白芍、川芎、當歸、熟地黃與CLI 之間均存在靶點交集，故均存在改善CLI 的可能，CLI 伴隨著膽汁淤積、肝損傷以及肝纖維化等異常改變，進一步通過BDL 手術模型模擬CLI 并評估單味藥藥效。

3.3.1 白芍、川芎、當歸、熟地黃對CLI 的改善作用 如圖3 所示，與假手術組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 活性顯著升高（P＜0.01、0.001），經治療后除熟地黃組外，白芍、川芎、當歸組對該指標均存在不同程度的改善（P＜0.05、0.001），但各單味藥治療組之間差異并不顯著，表明四物湯各單味藥均能改善CLI，其中白芍組的改善最為顯著。同時，對血清中ALP 活性及TBA、TBIL 含量檢測結果表明，白芍、川芎、當歸、熟地黃均能改善BDL誘導的膽管損傷和膽汁淤積情況。熟地黃對ALP 和TBIL 改善不顯著，當歸對TBIL 改善不顯著，但仍呈現改善病理狀態的趨勢。白芍、川芎總體療效略優于當歸、熟地黃。進一步檢測了肝組織中HYP 的含量，結果顯示BDL 術后小鼠肝臟出現了明顯纖維化改變（P＜0.001），經治療后白芍組、川芎組、當歸組、熟地黃組小鼠CLI 癥狀均明顯減輕（P＜0.001），組間差異并不顯著。據以上結果推測，白芍、川芎可能具有更顯著的抗CLI 療效。

圖3 各組小鼠血清ALT、AST、ALP 活性及TBA、TBIL 水平和肝臟HYP 含量 (±s , n = 8)Fig.3 ALT, AST, ALP activities, TBA, TBIL levels in serum and HYP content in liver tissue of mice in each group(±s , n = 8)

肝臟HE 染色結果見圖4，與假手術組比較，模型組可見明顯肝匯管區結構破壞，伴有大量炎性細胞浸潤和膠原沉積，經白芍、川芎、當歸、熟地黃水提物治療后上述病理改變均出現了不同程度的好轉，其中白芍組與川芎組的改善最為明顯。

圖4 各組小鼠肝臟病理變化 (HE，×20)Fig.4 Pathological changes in liver of mice in each group (HE, × 20)

為進一步檢測各組小鼠CLI 程度的變化，檢測了肝組織中CLI 相關基因表達。如圖5 所示，與假手術組比較，模型組小鼠肝臟中Acta2、Col1a1、Timp1、Mmp12、Mmp13、Mmp14基因表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；經白芍、川芎、當歸、熟地黃水提物治療后均出現了不同程度的逆轉，其中當歸、熟地黃對部分基因表達改善不顯著，白芍、川芎對以上基因表達均有顯著改善（P＜0.05、0.01、0.001），但各組間無統計學差異。結果表明，川芎組與白芍組對CLI 的改善作用最為明顯。

圖5 各組小鼠肝臟中Acta2、Col1a1、Timp1、Mmp12、Mmp13、Mmp14 基因表達 (±s , n = 8)Fig.5 Acta2, Col1a1, Timp1, Mmp12, Mmp13 and Mmp14 gene expressions in liver of mice in each group (±s , n = 8)

3.3.2 白芍、川芎、當歸、熟地黃與CLI 之間共同與獨立交集靶點的獲取 上述結果顯示，白芍、川芎、當歸、熟地黃均能改善CLI，推測各單味藥與CLI 之間可能存在共同的交集靶點；白芍與川芎對各項指標的改善顯著優于當歸組與熟地黃組，推測白芍、川芎可能存在不同于熟地黃、當歸的特異性靶向CLI 的靶點。將各單味藥與CLI 的作用靶點共同輸入生物信息學與進化基因組學網站，并繪制韋恩圖。結果顯示，白芍、川芎、當歸、熟地黃與CLI共同交集靶點為3 個。白芍與CLI 獨立的交集靶點有18 個，川芎與CLI 獨立的交集靶點有4 個，當歸、熟地黃與CLI 之間不存在獨立于其他藥物的交集靶點（圖6）。

圖6 各單味藥與CLI 的共同與獨立交集靶點Fig.6 Intersection of shared and unique targets between each individual herb and CLI

3.3.3 白芍、川芎、當歸、熟地黃通過3 個共同靶點改善CLI 上述結果顯示，白芍、川芎、當歸、熟地黃與CLI 共同交集靶點為3 個，分別為Nr3c2、Rxra、Ptgs2，使用qRT-PCR 進一步驗證了以上3 個靶點基因在各組小鼠肝臟中的表達。如圖7 所示，與假手術組比較，模型組中Nr3c2、Rxra、Ptgs2表達顯著升高（P＜0.05、0.001）；經白芍、川芎、當歸、熟地黃治療后以上基因表達均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。表明白芍、川芎、當歸、熟地黃可通過降低Nr3c2、Rxra、Ptgs2的表達共同改善CLI。

圖7 各組小鼠肝臟中Nr3c2、Ptgs2、Rxra 基因表達 (±s, n = 8)Fig.7 Nr3c2, Ptgs2 and Rxra gene expressions in liver of mice in each group (±s, n = 8)

3.3.4 白芍通過TNF 通路改善CLI 韋恩圖結果顯示，白芍與CLI 之間有18 個獨立交集靶點，這與推測相符合。為進一步證實白芍是否通過這些交集靶點特異性改善了CLI，將白芍對應的靶點基因進行GO 與KEGG 分析，GO 分析選取10 條主要結果顯示，發現白芍作用靶點富集于細胞凋亡、一氧化氮生物合成、炎癥反應、血管內皮生長因子產生、血管生成、一氧化氮合酶活性、肝再生、細胞遷移、細胞黏附等生物過程。KEGG 分析結果選取20 條主要信號通路，選擇了既往有大量研究報道與肝損傷相關[20-22]的TNF 信號通路，并推測白芍可能通過TNF 通路改善CLI（圖8）。

圖8 白芍GO 分析柱狀圖 (A) 和KEGG 分析氣泡圖 (B)Fig.8 Bar graph of GO analysis (A) and bubble graph of KEGG analysis (B) for Paeoniae Radix Alba

通過qRT-PCR 評估了白芍與CLI 的18 個獨立交集靶點并富集于TNF 通路中的Vcam1、Tnf、Mapk8、Akt1的表達水平，如圖9 所示，與假手術組比較，模型組小鼠肝臟中以上基因表達均顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，白芍治療后能顯著降低BDL 術后以上基因的高表達（P＜0.05、0.01），表明白芍可能通過TNF 通路改善CLI。

圖9 各組小鼠肝臟中Akt1、Mapk8、Tnf、Vcam1 基因表達 (±s, n = 8)Fig.9 Akt1, Mapk8, Tnf and Vcam1 gene expressions in liver of mice in each group (±s, n = 8)

3.3.5 川芎通過VEGF 通路改善CLI 根據韋恩圖結果，發現川芎與CLI 之間有4 個獨立交集靶點。將川芎的作用靶點進行GO 與KEGG 分析，GO 分析選取10 條主要結果顯示，川芎作用靶點富集于信號轉導一氧化氮合成、蛋白質磷酸化、細胞增殖、缺氧反應、血管內皮生長因子受體信號、細胞間信號傳導、血管生成等生物過程。KEGG 分析結果選取前20 條主要信號通路，考慮到既往大量研究結果顯示VEGF 通路與肝損傷過程密切相關[23-25]，推測川芎可能通過VEGF 通路改善CLI，選擇VEGF通路進行后續研究（圖10）。

圖10 川芎GO 分析柱狀圖 (A) 和KEGG 分析氣泡圖 (B)Fig.10 Bar graph of GO analysis (A) and bubble graph of KEGG analysis (B) for Chuanxiong Rhizoma

通過qRT-PCR 評估了川芎與CLI 的4 個交集靶點并富集于VEGF 通路中的Kdr、Mapk14的表達水平，如圖11 所示，與假手術組比較，模型組小鼠肝臟中以上基因表達水平顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，經川芎治療后以上基因表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），表明川芎可能通過VEGF 通路改善CLI。

圖11 各組小鼠肝臟中Kdr、Mapk14 基因表達 (±s , n = 8)Fig.11 Kdr and Mapk14 gene expressions in liver of mice in each group (±s , n = 8)

4 討論

膽汁淤積可能由多種原因引起，除了肝膽相關疾病、膽道結構異常、藥物、感染等因素外，近年來有研究報道了食物添加劑、膳食補充劑和腸外營養等所含的成分也可引發CLI[26]。CLI 可以導致黃疸、膽絞痛、消化不良、惡心、嘔吐、皮膚瘙癢、腹脹等各種癥狀和并發癥。CLI 涉及的病理機制復雜，病理過程較多，單一藥物成分或靶點往往只能改善部分病理指標，且難以阻止疾病的進一步發展。而中醫藥具有一方多藥、一藥多成分，以及多通路、多靶點共同作用的特點，可從多方面協同改善膽汁淤積引起的肝損傷及肝纖維化。本研究通過數據庫篩查，運用網絡藥理學方法構建了“四物湯單味藥-治療靶點-信號通路”網絡，并結合體內實驗評價藥效，探討四物湯治療CLI 的主要作用靶點和潛在作用機制。

以往已有大量研究報道了四物湯治療肝膽相關疾病的研究。一項臨床試驗報道了四物湯對肝臟具有的保護作用[9]。課題組前期研究發現四物湯不僅通過調節腸道微生物群和膽汁酸穩態，還通過調節免疫微環境以減少炎癥反應、改善CLI[10-11]。但目前尚無報道四物湯中4 味單藥改善肝損傷的療效對比研究，因此本研究對川芎、白芍、當歸、熟地黃改善CLI 進行了療效比較。結果顯示，川芎、白芍、當歸、熟地黃4 個單味藥均能改善CLI。將4 個單味藥與CLI 靶點取交集后發現它們通過3 個共同靶點（Nr3c2、Rxra、Ptgs2）作用于CLI。因此推測白芍、川芎、當歸、熟地黃可通過以上3 個靶點共同改善肝損傷，qRT-PCR 結果顯示，白芍、川芎、當歸、熟地黃可能均能下調肝臟中Nr3c2、Rxra、Ptgs2的表達。既往研究報道了這3 個靶點均與肝膽疾病密切相關，NR3C2、PTGS2 參與調控小鼠肝缺血再灌注損傷[27-28]，RXRA 在HSC 激活以及促進CLI 中發揮關鍵作用[29]。表明川芎、白芍、當歸、熟地黃可能通過調節Nr3c2、Rxra、Ptgs2共同改善了CLI。

考慮到白芍、川芎、當歸、熟地黃與CLI 之間交集靶點的差異性，以及川芎、白芍對CLI 的改善明顯優于當歸、熟地黃，推測川芎、白芍與CLI 之間是否存在相對獨立的特異性作用靶點。進一步分析結果顯示，白芍存在18 個獨立靶點作用于CLI，川芎存在4 個獨立靶點作用與CLI，而當歸、熟地黃不存在獨立作用靶點。對白芍的作用靶點進行GO 分析，發現靶點富集于炎癥、肝再生、血管生成等與肝損傷和纖維化密切相關的生物過程[30-32]，同時KEGG 分析顯示白芍靶點富集于TNF 信號通路。進一步評估了白芍與CLI 的獨立交集靶點基因，發現Vcam1、Tnf、Mapk8、Akt1等基因均富集于TNF通路，且在模型組明顯上調，而給予白芍治療后明顯下調，由此推測白芍可能通過TNF 通路相關基因改善了CLI。既往研究報道了VCAM1 促進LSEC毛細血管化和肝纖維化[33]；抑制TNF-α 可改善小鼠BDL 后的肝星狀細胞活化以及肝纖維化[34]；MAPK8 的表達與藥物性肝損傷相關[35]；Akt 在肝損傷伴隨的炎癥、細胞增殖、遷移和纖維形成中有著重要的作用[36]，這些基因均顯示出與肝損傷與肝纖維化的緊密相關性。此外，TNF 可作為上游基因誘導VCAM1 表達[37-38]，而VCAM1 可通過激活下游的Akt 和MAPK 信號傳導來增強細胞的增殖和遷移[39]。綜上，推測白芍可能通過TNF/VCAM1/Akt/MAPK 相關通路改善了CLI，其具體機制仍有待于進一步研究，以確定其上下游及相互作用關系。此外，GO 富集分析顯示川芎的作用靶點富集于與CLI密切相關的血管內皮生長因子、血管生成等生物過程；KEGG 分析顯示川芎靶點富集于VEGF 信號通路，這可能與其特異性改善CLI 有關。進一步評估了川芎與CLI 的獨立交集靶點基因，發現Kdr、Mapk14富集于VEGF 通路，二者在模型組明顯上調，而給予川芎治療后明顯下調，因此推測川芎通過VEGF 通路改善CLI。Kdr（VEGFR2）作為血管內皮生長因子受體，與血管生成以及肝纖維化顯著相關[40-41]，此外，抑制MAPK14 可緩解酒精引起的肝損傷[42]，同時MAPK14 為VEGFA 的上游調節因子[43]。因此，推測川芎可能通過MAPK14/VEGF/VEGFR2 相關通路改善CLI。

綜上，本研究基于網絡藥理學、生物信息學分析、體內動物模型和分子生物學手段，預測并驗證了四物湯防治CLI 的關鍵單味藥及其作用靶點。發現四物湯中各單味藥均能改善膽汁淤積引起的肝損傷及纖維化，4 個單味藥共同通過靶向Nr3c2、Rxra、Ptgs2發揮療效。此外，川芎、白芍顯示出更優藥效，白芍通過調控TNF 通路基因改善CLI，而川芎改善CLI 則與調控VEGF 通路相關。本研究為傳統方藥四物湯及其組成的臨床應用與機制研究提供了一定的科學依據，也為病理機制復雜的CLI 治療方案提供了理論指導。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突