MSCs通過抑制PI3K/Akt信號通路減輕VAP肺損傷的作用研究

朱建秋 羅幸 謝迎秋 主有峰

暨南大學附屬廣州紅十字會醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣州 510220

呼吸機相關(guān)性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）是機械通氣患者最常見的感染性疾病［1］。VAP可使機械通氣患者住院時間和ICU留置時間延長，抗菌藥物使用增加，并導致重癥患者病死率增加，嚴重影響重癥患者的預(yù)后，但其發(fā)病機制目前仍未完全清晰［2-3］。

一項前期針對老年機械通氣患者（≥75歲）的研究，分別比較了幽門后腸內(nèi)營養(yǎng)及胃內(nèi)營養(yǎng)對VAP發(fā)病率的影響；研究結(jié)果顯示，普通胃內(nèi)營養(yǎng)組患者VAP發(fā)病率高達25.4%，使用幽門后腸內(nèi)營養(yǎng)措施，可降低VAP發(fā)生率，但即使是使用了幽門后腸內(nèi)營養(yǎng)措施，患者的VAP發(fā)病率仍高達11.4%；進一步的事后分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生VAP的患者與未發(fā)生VAP患者相比較，病死率明顯增加，發(fā)生VAP組病死率超過50%以上［4］。

前期的動物研究顯示，當病原菌進入機械通氣患者肺泡內(nèi)，它們會觸發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，引起多種中介和急性期蛋白的表達增加，這可能與VAP的發(fā)生相關(guān)。這一系列的炎癥反應(yīng)包括了多種細胞因子，如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。VAP發(fā)生時，肺泡內(nèi)促炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）和抗炎性細胞因子［IL-10、白細胞介素1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA）、可溶性腫瘤壞死因子p55受體（soluble tumor necrosis factor p55 receptor，sTNFrp55）、sTNFrp75］表達失衡，存在過度的炎癥反應(yīng)，提示機械通氣時，肺泡內(nèi)過度失衡的炎癥反應(yīng)可能與VAP的發(fā)生有關(guān)［5］。這種過度的炎癥反應(yīng)與可在血清或支氣管肺泡灌洗液中檢測到的炎癥介質(zhì)的釋放相關(guān)，并且已顯示具有診斷和預(yù)后價值。最近的研究已經(jīng)證明，炎癥反應(yīng)增加是VAP的強預(yù)測因子［6］。

動物和體外研究揭示，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可提高動物和人體急性肺損傷（acute lung injury，ALI）模型肺泡滲出清除能力，改善肺組織通透性，減少急性肺損傷模型炎癥因子產(chǎn)生，從而產(chǎn)生治療作用［7-9］。但是，VAP發(fā)生時，MSCs的炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用對肺泡上皮細胞的炎癥反應(yīng)影響如何？若有影響，是否通過3組磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）信號途徑調(diào)控VAP時肺泡上皮細胞炎癥因子的表達？本課題擬針對該方面進行研究。

材料與方法

1.實驗動物

取SPF級健康雄性大鼠15只，體質(zhì)量180～200 g。實驗動物隨機分為3組（每組5只）：空白對照組、VAP組、VAP+MSCs組。研究時間為：2020年5月至2023年3月。本研究為動物實驗，嚴格遵循了單位和國家有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，并獲得倫理審批（倫理批件編號2019-145-01）。

2.機械通氣VAP模型制備方法

使用異丙酚（3 mg/kg）麻醉大鼠，在仰臥位進行氣管插管（可用適當型號的輸液器管路代替）。連續(xù)輸注咪達唑侖［0.3 mg/（kg·h）］、泮庫溴銨［0.3 mg/（kg·h）］和芬太尼［5 μg/（kg·h）］維持麻醉（具體劑量可根據(jù)實際情況調(diào)整）。銅綠假單胞菌菌株ATCC27853，劃線接種于血平板后，CO2孵箱37.5 ℃培養(yǎng)24 h，每24 h轉(zhuǎn)接一次，以保證活性。經(jīng)氣管插管向大鼠肺內(nèi)接種并均勻分布80 ml 106 cfu/ml銅綠假單胞菌懸浮液（對環(huán)丙沙星敏感，最低抑菌濃度0.5 μg/ml）。X線胸片肺部產(chǎn)生新滲出灶，證實VAP模型成功。

同樣使用異丙酚（3 mg/kg）麻醉空白組大鼠，空白組大鼠不做氣管插管及銅綠假單胞菌菌株ATCC27853接種處理，連續(xù)輸注咪達唑侖［0.3 mg/（kg·h）］、泮庫溴銨［0.3 mg/（kg·h）］和芬太尼［5 μg/（kg·h）］維持麻醉（具體劑量可根據(jù)實際情況調(diào)整）。

3.組織提取

空白組大鼠和機械通氣48 h后的兩組實驗大鼠，在麻醉狀態(tài)下安樂死后取樣，提取肺泡組織，同時VAP+MSCs組提取股骨及脛骨骨髓MSCs。

4.MSCs細胞提取和鑒定

4.1.骨髓單個核細胞（bone marrow-mesenchymal stem cells，BM-MNCs）的分離 過量戊巴比妥鈉處死動物后，取出雙側(cè)脛骨及股骨，按常規(guī)方法從大鼠雙側(cè)脛骨及股骨中沖出骨髓，應(yīng)用Ficoll梯度離心法分離出BM-MNCs，將所得細胞懸浮于聚丁二酸丁二醇酯［poly（butylene succinate），PBS］溶液，稀釋濃度為5×107/ml。

4.2.MSCs細胞分離及純化 將上述所得BM-MNCs，細胞形成克隆后，以1∶4稀釋倍數(shù)將克隆細胞擴增，形成80%豐度后，收集MSCs。

4.3.流式細胞儀鑒定MSCs 以2×105/ml的密度將細胞平均分配于流式管中，分別加入4 μl異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的CD44+CD45-CD90+CD71+，4 ℃避光孵育30 min。PBS沖洗2次，細胞沉淀中加入500 μl流式固定液，F(xiàn)ACS（fluorescence activated cell sorter）流式細胞儀鑒定。

5.檢測指標

將上述所得空白對照組、VAP組的肺泡上皮細胞單獨在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，VAP+MSCs組的MSCs與同一大鼠的肺泡上皮細胞在培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)，48 h后檢測3組PI3K、Akt以及TNF-α、IL-1α、γ-干擾素（interferon γ，IFN-γ）等炎癥因子的表達情況；通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）檢測細胞PI3K、Akt、TNF-α、IL-1α、IFN-γ mRNA的表達情況（PI3K Gene ID：18708，Akt Gene ID：11651）；通過酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測TNF-α、IL-1α、IFN-γ的表達水平。

6.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0版（IBM，美國）軟件進行分析，結(jié)果以均數(shù)（95%CI）表示，采用獨立樣本t檢驗比較兩組之間的計量資料，單因素方差分析（ANVOA）進行多組間計量資料分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.MSCs提取及鑒定

提取的大鼠BM-MNCs，經(jīng)FACS流式細胞儀鑒定，結(jié)果顯示MSCs標志物CD44+CD90+CD71+CD45-，說明提取的細胞為MSCs（圖1）。

圖1 流式細胞儀鑒定間充質(zhì)干細胞（MSCs）

2.大鼠肺泡上皮細胞培養(yǎng)液中炎癥因子表達水平

通過qPCR檢測3組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1α、IFN-γ mRNA表達情況，結(jié)果顯示，空白對照組炎癥因子TNF-α［Mean（95%CI）：1.759 8（1.626 0，1.893 6）］、IL-1α［Mean（95%CI）：1.583 8（1.466 3，1.701 3）］、IFN-γ mRNA表達水平［Mean（95%CI）：1.615 2（1.338 2，1.892 2）］最低，VAP組TNF-α［Mean（95%CI）：5.614 6（4.959 3，6.269 9）］、IL-1α［Mean（95%CI）：7.019 2（5.410 0，8.628 4）］、IFN-γ mRNA表達水平［Mean（95%CI）：7.179 6（6.451 9，7.907 3）］最高，高于另外兩組；而VAP+MSCs組炎癥因子TNF-α［Mean（95%CI）：2.623 8（2.004 0，3.243 6）］、IL-1α［Mean（95%CI）：3.512 4（2.743 6，4.281 2）］、IFN-γ mRNA水平［Mean（95%CI）：3.202 4（2.685 7，3.719 1）］雖高于空白對照組，但較VAP組下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖2）。通過ELISA檢測TNF-α、IL-1α、IFN-γ的表達水平，結(jié)果與mRNA檢測結(jié)果一致，空白對照組TNF-α［Mean（95%CI）：141.970 0（128.335 3，155.604 7）］、IL-1α［Mean（95%CI）：109.852 0（88.573 2，131.130 8）］、IFN-γ炎癥因子表達水平［Mean（95%CI）：98.806 0（70.185 5，127.426 5）］最低，VAP組TNF-α［Mean（95%CI）：382.926 0（315.735 9，450.116 1）］、IL-1α［Mean（95%CI）：422.738 0（344.701 2，500.774 8）］、IFN-γ炎癥因子表達水平［Mean（95%CI）：382.926 0（315.735 9，450.116 1）］最高，高于另外兩組，而VAP+MSCs組TNF-α［Mean（95%CI）：217.858 0（156.214 5，279.501 5）］、IL-1α［Mean（95%CI）：204.908 0（144.477 4，265.338 6）］、IFN-γ炎癥因子表達水平［Mean（95%CI）：217.858 0（156.214 5，279.501 5）］雖高于空白對照組，但較VAP組下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖2 qPCR檢測3組培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α（A）、IL-1α（B）、IFN-γ（C） mRNA表達情況

圖3 ELISA檢測3組培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α(A)、IL-1α(B)、IFN-γ(C)表達情況

3.肺泡上皮細胞培養(yǎng)液中PI3K、Akt表達水平

通過qPCR檢測3組培養(yǎng)液中PI3K、Akt mRNA表達情況。結(jié)果顯示，與炎癥因子表達水平相一致，空白對照組PI3K［Mean（95%CI）：1.664 4（1.311 0，2.017 8）］、Akt mRNA表達水平［Mean（95%CI）：1.906 0（1.665 8，2.146 2）］最低，VAP組PI3K［Mean（95%CI）：5.140 0（4.156 6，6.123 4）］、Akt mRNA表達水平［Mean（95%CI）：7.489 8（6.025 2，8.954 4）］最高，高于另外兩組，而VAP+MSCs組PI3K［Mean（95%CI）：3.000 4（2.240 1，3.760 7）］、Akt mRNA表達水平［Mean（95%CI）：3.564 4（3.154 6，3.974 2）］雖高于空白對照組，但較VAP組下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4）。研究結(jié)果提示，在VAP發(fā)生過程中，MSCs可能通過抑制PI3K/Akt信號通路從而抑制肺泡上皮細胞炎癥因子表達，從而達到抑制或減輕VAP的作用。

圖4 qPCR檢測3組培養(yǎng)液中PI3K(A)、Akt(B) mRNA表達情況

討論

研究顯示，PI3K/Akt信號通路在全身多個組織器官（腸道、呼吸道上皮細胞、心臟）的炎癥反應(yīng)過程中，均起到重要作用［10-13］。尹芳等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt被李斯特菌溶血素（listeriolysin O，LLO）激活后，可誘導呼吸道上皮細胞（16-HEB）產(chǎn)生炎癥因子IL-6、IL-1β，并促進細胞中黏蛋白5AC的表達。因此，我們推測PI3K/Akt信號通路在VAP患者肺泡上皮細胞炎癥反應(yīng)過程中亦起到重要作用。

研究已知，PI3K/Akt信號通路是MSCs發(fā)揮歸巢、分化、促血管內(nèi)皮細胞再生等功能的重要信號通路之一。在噪聲性耳蝸損傷大鼠模型中，PI3K/Akt信號通路是MSCs歸巢至耳蝸的重要信號通路，并可被PI3K抑制劑LY294002所抑制［14］。腫瘤方面的研究提示，MSCs可通過PI3K/Akt信號通路促進人骨肉瘤U2OS細胞的增殖和遷移［15］。動物和體外研究揭示，MSCs可提高動物和人體ALI模型肺泡滲出清除能力，改善肺組織通透性，減少ALI模型炎癥因子產(chǎn)生，從而產(chǎn)生治療作用［7-9］。

本研究檢測了PI3K/Akt及其下游炎癥因子在VAP大鼠肺泡上皮細胞中的表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，PI3K/Akt及其下游炎癥因子在VAP組大鼠肺泡上皮細胞中的表達升高，炎癥細胞浸潤更嚴重。這初步證實了我們的假設(shè)。而VAP+MSCs組PI3K/Akt及其下游炎癥因子，雖較空白對照組升高，但低于VAP組。提示在VAP發(fā)生過程中，MSCs可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，從而抑制肺泡上皮細胞炎癥因子表達，從而達到抑制或減輕VAP的作用。本研究初步揭示了這一現(xiàn)象，未來我們將通過敲除或過表達肺泡上皮細胞PI3K/Akt信號分子，同時與MSCs共培養(yǎng)，進一步證實MSCs抑制或減輕VAP的作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明朱建秋：醞釀和設(shè)計試驗，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析；羅幸：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析，支持性貢獻；謝迎秋：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，支持性貢獻；主有峰：醞釀和設(shè)計試驗，分析/解釋數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析，獲取研究經(jīng)費，行政、技術(shù)或材料支持，指導，支持性貢獻