全外顯子測序聯合基因組拷貝數變異測序在兒科遺傳病診斷中的應用

張華 劉敏 袁路 楊黎明 張富青

鄭州市婦幼保健院生殖遺傳科，鄭州 450012

遺傳性疾病，是指由于遺傳物質結構或者功能發生改變而導致的疾病，主要包括染色體病、單基因病、多基因病和線粒體病。盡管單一的遺傳病發病率比較低，但總體而言，遺傳病影響著總人口中的很大一部分，到目前為止，已經鑒定出7 000多種遺傳?。?］。隨著我國兒童疾病譜的變化及生育政策的調整，遺傳性疾病在兒科診療工作中越來越重要［2］。傳統的遺傳學檢測手段主要包括染色體核型分析和一代測序技術。核型分析可以檢出染色體非整倍體及大的結構異常，受分辨率影響，其檢出率極其有限；一代測序技術通量低、數據產出低且成本較高，也無法滿足當前臨床檢出對于高通量、高效率、高產出的測序需求。

人類基因組圖譜的完成和二代測序技術的出現是人類遺傳史的革命性改變，為遺傳病的研究提供了全新的思路［3］。自2008年首次描述使用［4］以來，對個體基因組測序和分析逐漸成為研究人類基因組變異的有力工具。人類基因組外顯子區域只占整個基因組的1%左右，卻包含了85%的致病基因［5］。因此，針對該區域的全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）技術可以檢出絕大多數單基因遺傳病的致病基因及變異。人類基因組的變異類型是多種多樣的，除了單個基因變異導致的單基因遺傳病外，染色體基因組拷貝數變異（copy number variations，CNVs）也是主要的變異類型?；蚪M拷貝數變異測序（copy number variation sequencing，CNVseq）技術不僅可檢出染色體非整倍體，還可檢出＞100 kb的CNVs。以往的研究多是單獨應用WES或者CNVseq，本研究我們回顧性分析本中心近年的兒科病例，探究WES聯合CNVseq對兒科遺傳病的檢出率，并對其應用價值進行探討。

對象與方法

1.研究對象

選取2019年8月至2023年7月，由鄭州市婦幼保健院新生兒科及兒科收治的疑似患有遺傳性疾病或臨床診斷不明確的住院患兒為研究對象。其中男性患兒18例，女性患兒15例。所有進行檢測的患兒父母均被知情告知該檢測項目的意義及局限性，并簽署知情同意書，本研究通過鄭州市婦幼保健院倫理委員會批準（ZZFY-LL-2023003）。

2.研究方法

2.1.WES檢測 采集患兒及其父母外周血各2 ml，用QIAamp全血DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取基因組DNA。進行酶法打斷，獲得長度為0～200 bp的DNA片段。采用NanoWES Human Exome V1.0試劑盒（中國貝瑞公司）對DNA片段進行雜交和捕獲。經洗脫、富集、PCR擴增、純化獲得全外顯子組上機文庫。通過NovaSeq6000測序儀（美國Illumina公司）進行二代測序，平均讀長為150 bp。

2.2.CNV-seq檢測 采集患兒及其父母外周血各2 ml，使用試劑盒提取基因組DNA，文庫構建試劑盒（北京貝瑞和康生物技術有限公司）構建文庫，通過Illumina NextSeq 500測序儀檢測全基因組的CNVs，測序類型為單端測序，讀長45 bp，平均測序深度0.1X。人類基因組參考序列版本為hg19，檢出CNVs分辨率為100 kb以上。

3.報告的解讀

3.1.WES結果解讀 測序完成后，去除測序數據中的接頭和低質量數據，用BWA軟件比對至參考基因組（hg38），對測序深度、均一性、探針特異性等進行統計分析。用Verita Trekker?變異位點檢測系統和Enliven?變異位點注釋解讀系統對數據進行分析，對單核苷酸多態性和插入缺失變異（InDel）等進行統計和分析，在1000 Genomes、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS及神州基因組數據庫（北京貝瑞和康生物技術有限公司）篩選頻率＜0.05，且經SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster等軟件預測結果均為致病性的位點作為與疾病相關的候選位點。參考美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南［6］對變異進行分類。

3.2.CNV-seq結果解讀 CNVs的注釋分析主要參考人群多態性數據庫（DGV）、病例數據庫（DECIPHER）和人類孟德爾遺傳在線數據庫（OMIM）。同時，參考基因劑量效應數據庫（ClinGen）分析拷貝數缺失、重復的意義。依據ACMG的遺傳變異解釋指南，將變異分為5類：“致病的”“可能致病的”“臨床意義未明的”“可能良性的”“良性的”。

結果

1.一般臨床資料

共納入研究對象33例，其中男性18例，女性15例，年齡范圍為1 d～8歲。1月齡內的患兒16例，1月齡至1歲患兒8例，＞1歲患兒9例。其父母均為非近親婚配的表型正常者。有2例患兒具有家族史，其父母曾生育同種表型患兒。見表1。

表1 33例行全外顯子測序聯合基因組拷貝數變異測序診斷遺傳病的患兒臨床資料

2.WES結果

5例患兒檢出致病性變異，7例患兒檢出可能致病性變異，本研究中WES的陽性檢出率為36.4%（12/33）。此外，還檢出臨床意義未明的變異5例（15.2%）。12例被明確診斷的患兒中共檢出變異14個，涉及16種單基因遺傳病，其中常染色體顯性遺傳病9種，常染色體隱性遺傳病2種，X連鎖隱性遺傳病4種，X連鎖顯性遺傳病1種；14個變異中，新發突變8個，遺傳突變6個。見表2。

表2 全外顯子測序檢出陽性患兒12例基因突變信息及相關疾病名稱

3.CNVseq結果

共檢出CNVs 8例，其中致病性CNVs 3例、臨床意義未明性CNVs 5例，CNVseq陽性檢出率為9.1%（3/33）。結果見表3。

表3 基因組拷貝數變異測序檢出陽性患兒3例基因突變信息及相關疾病名稱

討論

遺傳病是指由于遺傳物質的改變，導致基因功能異常而引發的一類疾病，主要包括染色體病、單基因病、多基因病、線粒體病及染色體CNVs導致的疾病。遺傳疾病表型多樣，由于多為先天性的，因此，在兒科人群中高發。受遺傳因素影響的患兒通常患有多系統疾病，發病率和病死率較高，與一般兒童相比，住院率更高，住院時間更長，醫療花費也更多［7-9］。兒童遺傳疾病的評估，依賴于?？漆t生的高度警覺，通常涉及復雜的臨床檢查評估手段，即使經過全面的評估，仍有相當一部分兒童難以得到明確診斷。這種診療現狀給家庭帶來了沉重的精神和經濟負擔。因此，盡早明確基因診斷具有十分重要的意義。傳統的遺傳學檢測手段主要包括染色體核型分析和基因芯片，但這兩種方法都有其明顯的局限性。核型分析只能檢出染色體非整倍體及大的結構異常，報告周期長，且有細胞培養失敗風險；基因芯片只能檢出探針覆蓋區域變異，而會漏檢探針未覆蓋區域的變異。得益于高通量測序技術的快速發展，WES和CNVseq檢測逐漸顯示出其優越性。WES可一次性對外顯子區域的20 000個基因進行測序，客觀輸出所有的測序數據，具有通量高、檢出已知和未知變異能力強、數據可再分析等優勢。CNVseq則對全基因組內微缺失微重復有較好的檢出能力。盡管WES和CNVseq已應用于臨床，但多為CNVseq—WES的序貫檢測策略，鮮有兩者同時聯合應用的相關研究［2］。我們對在本院兒科住院且無明確診斷的患兒同時運用WES和CNVseq檢測，探討兩種檢測方法聯合應用在兒科遺傳病診斷中的應用價值。

本研究中，WES在12例患兒中檢出致病性或可能致病性變異14個，陽性檢出率為36.4%（12/33）。這一結果明顯高于染色體核型分析及基因芯片的陽性檢出率［10-12］。同時，也高于多個WES研究報道的檢出率。Lee JY等［13］運用WES對92例疑似遺傳病患者進行檢測，檢出率為28.3%，Trujillano D等［14］的一項包含1 000個樣本的WES研究，檢出率為30.7%，齊志業等［15］報道WES在危重癥新生兒中的檢出率為27%。我們認為，導致各個研究報道的陽性檢出率具有差異的原因主要有兩個方面。首先，WES檢出率受納入研究對象臨床背景的影響，Nair P等［16］的研究結果提示按照疾病涉及的系統分類時，WES檢出率不同。Retterer K等［17］報道在各個系統中陽性檢出率從高到低依次為：聽力、視力、骨骼肌肉系統、骨骼系統、多發先天畸形、皮膚、中樞神經系統。其次，WES陽性檢出率還與檢測策略、研究對象年齡相關：家系WES比單獨先證者WES檢出率高［18］，兒童WES比成人WES檢出率高［19］，Posey JE等［20］對成人進行年齡分層研究發現，18～30歲組人群陽性檢出率顯著高于＞30歲組人群。因此，本研究陽性檢出率高于其他相關WES研究，可能是由于我們所納入的是兒童患者且應用了家系WES策略的緣故。

WES檢出的14個陽性變異共與16種單基因遺傳病相關，其中有兩個變異分別與三種單基因病相關。根據遺傳方式分類，出現頻率最高的為常染色體顯性遺傳（56.2%，9/16），這與Yang Y等［19］、Posey JE等［20］的研究結果一致。我們注意到，也有一些研究結果與此相反，提示常染色體隱性遺傳為最主要的遺傳方式［15-16，21-22］。這可能與他們納入的研究對象有關，其研究的多是遺傳代謝性疾病或父母具有高血親率的患者，因此，導致常染色體隱性遺傳病的出現頻率增高。本研究中的14個陽性基因變異中，有8個為新發突變，6個為遺傳突變。87.5%（7/8）的新發突變涉及到常染色體顯性遺傳。有研究指出，常染色體顯性遺傳性疾病的檢出率受父母樣本是否可用的影響［20］，因為這類疾病涉及到的突變多數是首次報道的，而這種情況下更需要做父母驗證來評估其致病性。

目前，WES檢測多推薦先證者及先證者父母的三人家系檢測，以提高檢出效率。事實上，在條件允許的情況下，不應局限于三人家系檢測，家系里參與WES檢測的人越多，越有利于評估變異的致病性及與疾病的相關性。本研究中的病例P24，因尿道下裂、陰莖短小、隱睪、小頭畸形等異常表型進行WES檢測。該患兒系第二胎第二產，其母孕期無創DNA檢測低風險，羊水穿刺染色體微陣列分析（CMA）無異常。WES結果提示，該患兒X染色體OGT基因發c.3093C＞G突變，其父親為野生型，母親為雜合攜帶者。根據ACMG指南，該患兒遺傳突變的評級為臨床意義未明?？紤]到該病例涉及X連鎖隱性遺傳，且患兒有一表型正常的哥哥，我們與患兒家屬溝通后對患兒哥哥采樣進行分析。結果表明，患兒哥哥為野生型，符合基因型-表型共分離，因此，該位點經再次評估后升級為可能致病性變異。一項包含3 040位參與者的大樣本WES研究結果表明，當只有先證者進行WES檢測時，陽性檢出率為23.6%，當有3個家庭成員參與檢測分析時，陽性檢出率提高至31.0%［18］。因此，對于臨床WES檢測，我們建議在條件允許的情況下進行多家系成員的WES分析，以提高陽性檢出率。

家族史是遺傳病的一個特征，但其與分子學檢測陽性檢出率的關系鮮有研究。我們注意到，一項針對成人的WES研究指出，家族史不能成為預測分子診斷陽性的指標［20］。不過，我們的研究與之相反，24例患兒中，具有家族史的2個病例均得到了陽性診斷結果。病例P15的主要臨床表型為癲癇，腦癱，具有家族史，其父母曾生育一個癲癇患兒，已夭折。該患兒經WES檢出SLC13A5基因存在兩個突變：c.997C＞T突變遺傳自其父親，第6外顯子缺失突變遺傳自其母親，因此構成復合雜合突變，從而導致常染色體隱性遺傳病——早期嬰兒癲癇性腦病25的發生。病例P23主要臨床表型為嚴重精神發育遲滯，皮膚魚鱗病，具有家族史，其姐姐精神發育遲滯，癲癇，已夭折。該患兒檢出MPDU1基因存在兩個突變：c.389G＞A突變遺傳自其父親，c.470T＞C突變遺傳自其母親，從而導致常染色體隱性遺傳病——先天性糖基化障礙If型的發生。這兩個病例提示我們，當患者具有家族史，尤其是其同胞具有相同或者高度相似的臨床表型時，可能是常染色體隱性遺傳病的一種提示。因此，臨床醫生一定要盡可能充分地收集患者的臨床信息及家系成員情況。其次，對于該類患者，一定要明確其父母的基因型，以便為該家庭的遺傳咨詢提供依據，并對有再次妊娠需求的夫婦給予指導。

相較于單核苷酸變異，人類對于CNVs的認識相對較晚。2006年，Redon R等［23］繪制了人類基因組拷貝數變異圖譜，發現CNVs廣泛存在于人類基因組中。隨著測序技術的快速發展，被鑒定發現的CNVs數量越來越多，并且有相當數量的CNVs與人類疾病密不可分，如數百種微缺失微重復綜合征、智力缺陷、自閉癥、神經發育障礙等［24-27］。本研究中，我們利用CNVseq方法共檢出CNVs 8例，明確致病性變異3例，陽性檢出率為9.1%。該結果提示我們，在兒童遺傳性疾病診斷中，不應忽視CNVs的重要性。明確診斷的3例患兒中有2例為7q11.23缺失導致的威廉姆斯-伯倫綜合征（Williams-Beuren syndrome，WBS）。大約95%的WBS患兒存在7q11.23染色體區域的1.5～1.8 Mb缺失，即典型缺失，約5%的患兒存在超出7q11.23區域的缺失，即不典型缺失。我們檢出的2例WBS患兒均屬于典型缺失，缺失片段大小分別為1.42 Mb和1.54 Mb，這樣的染色體結構變異是常規核型分析是無法檢出的。病例P33為第一胎第一產，其母在孕早期超聲檢查結果未見異常，孕后期羊水增多，因無創DNA檢測低風險而放棄進一步產前診斷。該病例提醒我們，普通無創DNA檢出范圍僅為13、18及21三大染色體三體，會有漏檢CNVs的風險。并且胎兒CNVs發病率與孕婦年齡無關［28］，所有年齡段的孕婦都應警惕CNVs風險。

我們看到，當WES及CNVseq聯合使用時，總陽性檢出率可提高至45.5%（15/33），這一結果顯著優于單一檢測的陽性率。此外，同步進行聯合檢測模式還可降低DNA起始量，縮短報告周期，使患者盡早得到診斷。近幾年，有不同的研究報道指出，對初次WES檢測后沒有得到明確診斷的患者進行數據重分析可使部分患者得到診斷，提高診斷率。Ewans LJ等［29］的研究結果表明其數據重分析提高了約11%的分子診斷率，Jalkh N等［30］的研究結果則提高了6.5%。因此，本研究的數據結果可能通過今后的定期重分析，可增加對當前意義不明的變異解釋，使未得到診斷的患兒將來得到最終的精準診斷。

綜上，WES聯合CNVseq是兒童遺傳性疾病分子診斷的有力工具，可作為一線檢測方法，在臨床大力推廣。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明張華：構思與設計、資料收集、數據整理、論文撰寫；劉敏：構思與設計、資料收集、提供案例；袁路：提供案例，數據整理；楊黎明：數據整理、文獻整理；張富青：構思與設計、提供案例、論文指導