新型吡唑乙酰胺類琥珀酸脫氫酶抑制劑的設計、合成及抑菌活性

王曉斌，董 雪，王瑞穎，張 娟，王濛琪，張宗群，楊婷玉，許夢寒

（1.江蘇海洋大學藥學院,江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室,2.海洋工程學院,海洋工程技術研究中心,連云港 222005；3.南京農業大學理學院,江蘇省農藥學重點實驗室,南京 210095）

農用殺菌劑在保護農作物免受植物病原真菌侵擾方面發揮著極其重要的作用［1，2］.然而，農用殺菌劑的廣泛應用也逐漸暴露了兩個亟待解決的問題：（1）部分殺菌劑存在對非靶標生物毒性較大、對環境危害嚴重的弊病，因與人們逐漸增強的生態環保意識相沖突而被限制使用［3～5］；（2）一些殺菌劑長期及不當的使用導致病原真菌迅速產生抗藥性，從而制約了我國重大農業病害防控工作的有效開展［6～8］.因此，創制應用效果更好、對非靶標生物選擇性更強且對環境安全系數更高的綠色殺菌劑對保障我國的糧食安全和促進農業的可持續發展具有重要意義［9，10］.

琥珀酸脫氫酶（SDH）是位于真菌線粒體電子傳遞鏈上的一類膜蛋白復合物，其活力的強弱對真菌生存所需能量的獲取和存儲有著重要的影響，是抑菌劑創制領域廣受關注的靶標之一［11～13］.自1966年以來，先后共有24個琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）被開發用作農用殺菌劑，其分子的核心藥效團為芳基甲酰胺結構，特別是氟代吡唑甲酰胺單元在維持SDHIs 廣譜高效抑菌活性方面起到了重要作用［14～16］.然而，過于相似的分子結構會使SDHIs在長期施用后產生較嚴重的交互抗性［17，18］.近期，研究人員發現氟吡菌酰胺（Fluopyram）、氟唑菌酰羥胺（Pydiflumetofen）和Isoflucypram 等含三元或四元柔性酰胺鏈的SDHIs［結構見Scheme 1（A）］對因使用萎銹靈（Carboxin）、啶酰菌胺（Boscalid）和吡噻菌胺（Penthiopyrad）等含二元酰胺鍵的SDHIs［結構見Scheme 1（B）］而產生抗性的菌株依舊保持良好的抑制活性［19～22］，這使得對SDHIs酰胺鍵進行柔性改造成為高效廣譜殺菌劑開發的重要策略［23，24］.

Scheme 1 Representative SDHIs bearing a flexible amide linkage(A) or commercialized SDHIs bearing a dualistic amide linkage(B)

鑒于柔性酰胺鏈在SDHIs 抑菌活性方面展現的獨特優勢，本文將吡唑甲酰胺殺菌劑結構中的甲酰胺單元替換為柔性更為出眾的乙酰胺連接鏈，合成了一系列潛在靶向真菌SDH 的新型吡唑乙酰胺分子（結構見Scheme 2）.隨后，采用菌絲生長速率法測定了吡唑乙酰胺目標分子對水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）的抑制活性，并運用SDH酶活力測試和分子對接技術初步探討了高活性分子對真菌SDH的潛在作用方式.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

三氟乙酰乙酸乙酯、溴乙酸乙酯、溴乙烷、氫氧化鈉、取代苯胺和O-苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲四氟硼酸（TBTU），分析純，上海泰坦科技股份有限公司；甲基肼水溶液（質量分數為40%），瑞士Adamas公司；BC0955型琥珀酸脫氫酶測試盒，北京索萊寶科技有限公司.

BRUKER-400型核磁共振波譜儀（NMR），德國Bruker公司；Triple TOF 5600 plus LC/MS/MS型高分辨質譜儀（HRMS），美國ABSciex 公司；SMP-50 型全自動數字熔點儀，英國Bibby 科學有限責任公司；ZF-1A 型三用紫外分析儀，上海勤科分析儀器有限公司；OSB-2100 型旋轉蒸發儀，日本EYELA 公司；ELX800型酶標儀，美國Bio-Rad公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 中間體2-［5-羥基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基］乙酸（2）的合成 在100 mL 乙醇中加入14.62 mL（0.10 mol）三氟乙酰乙酸乙酯，16.58 g（0.12 mol）碳酸鉀和1.66 g（0.01 mol）碘化鉀，常溫下攪拌10 min后加入16.63 mL（0.15 mol）溴乙酸乙酯，加熱至回流并反應8 h.減壓蒸餾除去多余乙醇，所得殘渣用乙酸乙酯溶解，經水洗除去鉀鹽，再次減壓蒸餾得到含2-（2，2，2三氟乙酰基）琥珀酸二乙酯（中間體1）的黃色液體.將上述黃色液體溶于100 mL乙醇，加入13.24 mL（0.10 mol）甲基肼水溶液后加熱回流反應8 h；加入8.00 g（0.20 mol）氫氧化鈉后再次回流反應4 h.減壓蒸餾除去多余乙醇，殘渣用水溶解后用乙酸乙酯洗滌.隨后用鹽酸調節水相體系pH值為2，以乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鈉干燥，經減壓蒸餾得到中間體2白色粉末.

1.2.2 中間體2-（5-乙氧基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基）乙酸（5）的合成 將8.94 g（0.04 mol）中間體2溶于100 mL甲醇，加入少量濃硫酸后加熱回流反應8 h，經減壓蒸餾除去多余甲醇，所得殘渣用乙酸乙酯溶解，經水洗除去硫酸，用無水硫酸鈉干燥，再次減壓蒸餾得到2-［5-羥基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基］乙酸甲酯（中間體3）.在100 mL 乙腈中加入9.53 g（0.04 mol）中間體3、4.48 mL（0.06 mol）溴乙烷和6.63 g（0.05 mol）碳酸鉀，加熱回流反應10 h；經減壓蒸餾得到含2-［5-乙氧基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基］乙酸甲酯（中間體4）的黃色油膏.將上述黃色油膏加入質量分數為5%的氫氧化鈉溶液（64.00 mL）中，加熱反應2 h后用鹽酸調節體系pH值為2，用乙酸乙酯萃取，經無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到中間體5白色粉末.

1.2.3 目標化合物6a～6j的合成 化合物6a～6j的合成路線見Scheme 3（A）.將0.76 g（3.00 mmol）中間體5加入15 mL氯化亞砜中，攪拌并加熱至回流反應8 h.經減壓蒸餾除去多余氯化亞砜后，所得殘渣用25 mL 二氯甲烷溶解，加入3.00 mmol 取代苯胺和1.25 mL（9.00 mmol）三乙胺，常溫下攪拌10 h 后用水洗滌，有機相用無水硫酸鈉處理，經減壓蒸餾除去多余二氯甲烷，所得殘渣用質量分數為95%的乙醇溶液重結晶，得到目標產物6a～6j.

Scheme 3 Synthetic routes of target compounds 6a—6j(A) and 6k,6l(B)

1.2.4 目標化合物6k 和6l 的合成 化合物6k 和6l 的合成過程見Scheme 3（B）.將0.67 g（3.00 mmol）中間體2，3.00 mmol取代苯胺和1.25 mL（9.00 mmol）三乙胺加入25 mL二氯甲烷中，攪拌10 min后加入1.16 g（3.60 mmol）TBTU，常溫下繼續攪拌反應10 h.所得反應液經水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾及乙醇（質量分數為95%）重結晶得到目標產物6k和6l.

1.2.5 中間體2 和5 及目標分子6a～6l 的表征 化合物結構經1H NMR，13C NMR，19F NMR 和HRMS 確證.中間體2和5及目標分子6a～6l的的理化性質和表征數據如表1和表2所示，相關譜圖見本文支持信息圖S1～圖S56.

Table 1 Appearance,yields,melting points(m.p.),19F NMR and HRMS data of compounds 2,5 and 6a—6l

Table 2 1H NMR and 13C NMR data of compounds 2,5 and 6a—6l

1.3 抗植物病原真菌活性測試

以農用殺真菌劑噁霉靈（Hymexazol）和氟吡菌酰胺為陽性對照，采用菌絲生長速率法測定了目標分子6a～6l對水稻紋枯病菌，草莓灰霉病菌和小麥赤霉病菌的抑制效果［25～27］.上述菌株由南京農業大學江蘇省農藥學重點實驗室提供.

1.4 水稻紋枯病菌SDH的提取及活力測試

參照文獻［23，24］方法提取水稻紋枯病菌的SDH，并利用琥珀酸脫氫酶測試盒測定了目標分子6l對水稻紋枯病菌SDH的抑制活性.

1.5 同源模建和分子對接

參照文獻［23，24］方法構建了水稻紋枯病菌SDH 蛋白，并基于此蛋白模型進行了目標分子6l 與SDH的分子對接研究.

2 結果與討論

2.1 目標化合物的合成及結構表征

如Scheme 2所示，三氟乙酰乙酸乙酯在碳酸鉀作用下與溴乙酸乙酯發生親核反應，生成的含三氟乙酰基的琥珀酸二乙酯隨即在堿性條件下與甲基肼發生環化作用，得到吡唑乙酸類中間體2.中間體2與甲醇發生酯化反應，所得產物依次與溴乙烷和氫氧化鈉溶液發生反應，得到另一個含有吡唑乙酸骨架的中間體5.中間體5與氯化亞砜發生氯代反應后，在三乙胺存在下與取代苯胺發生酰胺化反應得到目標分子6a～6j.此外，在含三乙胺的二氯甲烷中，中間體2在TBTU 作用下與取代苯胺發生酰胺化反應得到目標分子6k和6l.所構建分子6a～6l的結構通過1H NMR，13C NMR，19F NMR和HRMS方法進行確證，相關結構數據列于表1和表2，相應譜圖見本文支持信息圖S9～S56.

以目標分子6b 的表征數據解析為例進行具體分析.在化合物6b 的1H NMR 譜圖中，δ10.27 處的單峰為酰胺鍵上質子氫的信號峰；δ7.59 和7.36 處的雙峰分別為苯胺鄰位和間位質子氫的信號峰；δ4.26和1.31處的四重峰和三重峰是吡唑5位乙氧基質子氫的信號峰；δ3.71和3.54處的單峰分別為吡唑1位甲基和吡唑4位亞甲基質子氫的信號峰.在化合物6b的13C NMR譜圖中，δ168.55處的吸收峰為酰胺羰基碳的信號峰；δ122.12 和139.49 處的四重峰為三氟甲基和吡唑3 位碳的信號峰；δ152.67和99.41處的吸收峰分別是吡唑5位和4位碳的信號峰；δ138.49～121.14處的吸收峰為苯環碳的信號峰；δ71.82和15.60處的吸收峰為吡唑5位乙氧基碳的信號峰；δ35.19和29.40處的吸收峰分別是吡唑4位亞甲基和吡唑1位甲基碳的信號峰.在化合物6b的19F NMR譜圖中，δ-60.40處的吸收峰為三氟甲基氟的信號峰.化合物6b的HRMS譜圖顯示，［M+Na］+離子峰的吸收信號為m/z384.0687，與其分子式C15H15ClF3N3O2［M+Na］+的計算值m/z384.0697十分接近.

2.2 目標分子的抑菌活性

為考察苯胺上取代基類型對抑菌活性的影響，首先合成了目標分子6a～6j，并采用菌絲生長速率法測定了上述10個分子在藥劑質量濃度為50 μg/mL時對水稻紋枯病菌，小麥赤霉病菌和草莓灰霉病菌的抑制活性.測試結果（表3）表明，化合物6b，6g和6h在藥劑質量濃度為50 μg/mL時對水稻紋枯病菌的抑制效果最優，抑制率分別為35.33%，37.11%和40.00%，與對照藥劑噁霉靈和氟吡菌酰胺保持相當.同時，化合物6b，6d和6g在藥劑質量濃度為50 μg/mL時對小麥赤霉病菌的抑制效果較明顯，抑制率分別達到16.92%，20.59%和26.97%.此外，化合物6b，6g和6h在藥劑質量濃度為50 μg/mL時對草莓灰霉病菌也展現出較明顯的抑制效果，抑制率分別達到28.49%，20.70%和20.43%.上述抑菌測試結果表明，在苯胺苯環的對位引入氯原子和4-氯苯氧單元能顯著改善分子骨架的抑菌活性.

Table 3 Antifungal activities of compounds 6a—6l at 50 μg/mL

為探索吡唑5 位取代基類型對抑菌活性的影響，在保留苯環對位氯原子和4-氯苯氧單元的基礎上，構建并測定了目標分子6k和6l在藥劑質量濃度為50 μg/mL時對3種測試真菌的抑制活性，結果如表3所示.抑菌測試結果表明，化合物6l在藥劑質量濃度為50 μg/mL時對水稻紋枯病菌，小麥赤霉病菌和草莓灰霉病菌的抑制效果（65.78%，46.82%和62.10%）均優于化合物6g（37.11%，6.97%和20.70%）.同時，化合物6k 在藥劑質量濃度為50 μg/mL 時對草莓灰霉病菌的抑制效果（51.08%）也顯著優于化合物6b（28.49%）.上述結果表明，將改善分子吡唑5位的乙氧基替換為羥基能顯著改善所得分子的抑菌效果.化合物6l在藥劑質量濃度為50 μg/mL時對水稻紋枯病菌的抑制效果（65.78%）顯著優于對照藥劑噁霉靈和氟吡菌酰胺（33.90%和56.25%）.抑菌活性測試結果（圖1和表4）表明，化合物6l 對水稻紋枯病菌的半最大效應濃度（EC50）值為19.92 μg/mL，其活性顯著優于對照藥劑噁霉靈（76.74 μg/mL）和氟吡菌酰胺（40.36 μg/mL）.

Fig.1 Anti-R.solani effects of compound 6l

Table 4 Inhibitory effects of compound 6l against R.solani and their SDH

2.3 化合物6l與水稻紋枯病菌SDH的分子對接研究

為探究SDH 是否為化合物6l 分子的潛在作用靶標，測定了化合物6l 對水稻紋枯病菌SDH 的抑制效果.由表4結果可見，化合物6l對水稻紋枯病菌SDH的半數抑制濃度（IC50=61.53 μmol/mL）要明顯優于氟吡菌酰胺（105.90 μmol/mL），證實真菌體內的SDH是化合物6l抑菌活性發揮的潛在作用靶標.隨后，通過同源模建的方法獲得了水稻紋枯病菌SDH的蛋白模型，并運用Autodock 4.2.6程序進一步探究了化合物6l分子與水稻紋枯病菌SDH的潛在作用方式（圖2）.分子對接研究結果表明，化合物6l分子和氟吡菌酰胺以近似相同的構象嵌入琥珀酸脫氫酶上的活性口袋中，同時這兩個活性分子與周圍殘基的相互作用方式也基本相同.如，殘基ARG 81和TYR 128通過氫鍵與化合物6l 和氟吡菌酰胺發生相互作用，殘基ILE 230，ILE 78，VAL 82借助Pi-Alkyl和Alkyl的方式與上述兩個活性分子發生相互作用.上述作用方式在一定程度上維持了化合物6l分子對植物病原真菌的抑制活性.其次，化合物6l分子中的二苯醚單元以Alkyl和Pi-Alkyl的方式與殘基ILE 78，VAL 82和PHE 121發生作用，這可能是含二苯醚單元的目標分子對植物病原真菌抑制活性明顯優于其它目標分子生物活性的重要原因.此外，化合物6l中的吡唑5位羥基通過氫鍵與殘基TYR 128發生作用，這可能是含羥基的吡唑乙酰胺分子在抑菌表現方面優于含乙氧基吡唑乙酰胺分子的重要原因.

3 結論

鑒于酰胺鏈柔性改造在新型SDHIs創制方面展現的獨特優勢，將吡唑甲酰胺殺菌劑結構中的甲酰胺單元替換為柔性更為出眾的乙酰胺連接鏈，構造了一系列潛在靶向真菌SDH 的新型吡唑乙酰胺分子.經1H NMR，13C NMR，19F NMR和HRMS確證分子結構后，采用菌絲生長速率法測定了上述分子對植物病原真菌的抑制活性.通過抑菌活性測試發現了具有廣譜抑菌特性的二苯醚聯吡唑乙酰胺分子6l，其在藥劑質量濃度為50 μg/mL 時對水稻紋枯病菌，小麥赤霉病菌和草莓灰霉病菌的抑制率（65.78%，46.82%和62.10%）與對照藥劑噁霉靈（33.90%，46.86%和61.04%）保持相當.生物活性測試結果表明，化合物6l 對水稻紋枯病菌的EC50值為19.92 μg/mL，抑菌活性明顯優于對照藥劑噁霉靈和氟吡菌酰胺（76.74 μg/mL 和40.36 μg/mL）.SDH 酶活力測試結果證明真菌體內的SDH 是化合物6l抑菌活性發揮的潛在作用靶標，其對水稻紋枯病菌SDH的IC50值（61.53 μmol/mL）要明顯優于氟吡菌酰胺（105.90 μmol/mL）.進一步的分子對接研究表明，化合物6l分子中的二苯醚單元能以多種方式與靶標口袋內的氨基酸結合，對分子抑菌活性的發揮起到關鍵作用.研究結果表明，二苯醚聯吡唑乙酰胺分子對植物病原真菌具有較顯著抑制作用，具備作為優勢抑菌先導結構進行深度發掘的潛力.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20230444.