無創(chuàng)產(chǎn)前檢測在篩查胎兒染色體拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用價值分析

彭 圓,黃曉莉

(淮安市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前篩查科,江蘇 淮安 223002)

染色體拷貝數(shù)變異(chromosome copy number variations,CNVs)一般是指整倍體、非整倍體等染色體數(shù)目異常以外,由染色體結(jié)構(gòu)片段變異引起的遺傳性疾病,通常又稱為染色體微缺失微重復(fù)。由于CNVs可以影響受精卵形成過程中遺傳物質(zhì)信息錯誤傳遞,也是導(dǎo)致不孕不育、受孕后自然流產(chǎn)及出生缺陷等不良事件的原因之一。已有報道的致病性CNVs近300種,合并發(fā)病率近0.17%(1/600)[1]。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)技術(shù)是從孕婦外周血中提取胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA),通過新一代高通量測序技術(shù),再結(jié)合生物信息分析,得出cffDNA相對量,計算出胎兒染色體異常的風(fēng)險率。在本研究前期進(jìn)行的NIPT中發(fā)現(xiàn),除常規(guī)的21三體、18三體、13三體等染色體數(shù)目異常及性染色體疾病具有較高的陽性預(yù)測值外[2],染色體拷貝數(shù)的缺失或重復(fù)也具有較高的陽性預(yù)測值。因此,本研究選擇在淮安市婦幼保健院行NIPT且結(jié)果提示可能為胎兒CNVs的孕婦為研究對象,對其產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局進(jìn)行回顧性分析,探討NIPT技術(shù)在篩查胎兒CNVs中的應(yīng)用價值。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

2018年1月至2021年7月在淮安市婦幼保健院進(jìn)行NIPT的孕婦有21 389例,選擇NIPT結(jié)果提示可能為胎兒CNVs的224例孕婦為研究對象;對其中171例孕婦進(jìn)行了羊水穿刺及進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷[羊水染色體核型分析及染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)],所有171例接受產(chǎn)前診斷的孕婦均簽署羊水穿刺知情同意書,告知羊水染色體核型分析及CMA的價值及局限性,獲得胎兒羊水樣本171例。孕婦的年齡為21～46歲,平均為(25.2±3.2)歲;孕周為19～31周,平均為(23.1±2.1)周。通過門診和電話隨訪等方式對所有研究對象進(jìn)行妊娠結(jié)局和新生兒情況的隨訪。

納入標(biāo)準(zhǔn):單胎,自然妊娠的孕婦在1年內(nèi)未接受過輸血、移植手術(shù)或細(xì)胞治療。排除標(biāo)準(zhǔn):孕婦血清TORCH檢測結(jié)果陽性,夫妻雙方已知存在染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。

本研究已通過淮安市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號:2019036)。

1.2 方法

1.2.1 NIPT方法

在無菌條件下,隨機抽取孕婦外周血10mL,送遺傳實驗室進(jìn)行測序,測序設(shè)備為北京博奧生物集團有限公司的高通量測序儀(BioelectronSeq 4000),DNA提取試劑盒(磁珠法)為廣東博奧木華基因科技有限公司生產(chǎn)。使用生物信息軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析,獲取樣品染色體所占比例的Z值信息,以|Z|=3為風(fēng)險截斷值,|Z|<3時判定為染色體非整倍體低風(fēng)險,|Z|≥3時判定為染色體非整倍體高風(fēng)險。對于21三體、18三體、13三體出具正式報告,其他染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常出具輔助報告。對于所有NIPT提示21三體、18三體、13三體高風(fēng)險或者其他染色體可能存在異常的孕婦,建議進(jìn)一步進(jìn)行遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和超聲系統(tǒng)篩查。

1.2.2羊水穿刺術(shù)及染色體核型分析和CMA

在行羊水穿刺術(shù)前,應(yīng)用彩色多普勒超聲探查確定穿刺點,避開胎盤、胎兒,消毒、鋪巾、進(jìn)針,抽得2份20mL羊水樣本,其中1份按照規(guī)范進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)、中期染色體核型制備及核型分析,另1份按照試劑盒的操作說明進(jìn)行規(guī)范的基因組DNA提取,通過質(zhì)檢后,用單核苷酸微陣列技術(shù)(Affymetrix CytoScan 750K)進(jìn)行胎兒羊水CMA。

根據(jù)羊水穿刺結(jié)果從胎兒CNVs的不同類型和CNVs的不同片段兩方面進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計數(shù)資料以例數(shù)(n)和百分率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NIPT結(jié)果及產(chǎn)前診斷結(jié)果的比較

在21 389例孕婦中,經(jīng)NIPT提示可能為胎兒CNVs的孕婦共有224例,其檢出率為1.05%(224/21 389),對171例孕婦進(jìn)行了羊水穿刺及進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷,穿刺率為76.34%(171/224),其中95例確診為胎兒CNVs,總陽性預(yù)測值為55.56%(95/171)。

根據(jù)CNVs不同類型分組,NIPT檢出情況顯示,微缺失組占所有CNVs的54.02%(121/224),微重復(fù)組占所有CNVs的39.73%(89/224),微缺失合并微重復(fù)組占所有CNVs的6.25%(14/224),見表1。

表1 不同類型CNVs的檢出及診斷情況

根據(jù)CNVs不同片段分組,NIPT檢出情況顯示,>10Mb組占所有CNVs的18.75%(42/224),5～10Mb組占所有CNVs的20.54%(46/224),<5Mb組占所有CNVs的60.71%(136/224),見表2。

表2 不同片段CNVs的檢出及診斷情況

2.2 胎兒CNVs的陽性預(yù)測情況

在CNVs不同類型組中,微缺失組NIPT與羊水穿刺診斷結(jié)果符合51例,陽性預(yù)測值為56.67%;微重復(fù)組NIPT與羊水穿刺診斷結(jié)果符合36例,陽性預(yù)測值為50.70%;微缺失合并微重復(fù)組NIPT與羊水穿刺診斷結(jié)果符合8例,陽性預(yù)測值80.00%,三組間陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 CNVs不同類型和片段陽性預(yù)測值的比較

在CNVs不同片段組中,>10Mb組NIPT與羊水穿刺診斷結(jié)果符合21例,陽性預(yù)測值為56.76%;5～10Mb組NIPT與羊水穿刺診斷結(jié)果符合21例,陽性預(yù)測值為60.00%;<5Mb組NIPT與羊水穿刺診斷結(jié)果符合53例,陽性預(yù)測值為53.54%,三組間陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

在CNVs片段<5Mb組中,檢測出2例CMA結(jié)果未見異常,但羊水染色體核型分析結(jié)果提示異常,1例為9號染色體臂間倒位,核型結(jié)果為46,XN,inv(9)(p11q13);另1例為2號與3號染色體間的平衡異位,核型結(jié)果為46,XN,t(2;3)(q37;p11)。

2.3 產(chǎn)前診斷結(jié)果有關(guān)的妊娠結(jié)局情況

根據(jù)羊水穿刺結(jié)果顯示,確診胎兒CNVs共95例,經(jīng)過與細(xì)胞基因組陣列的國際標(biāo)準(zhǔn)(international standards for cytogenomic arrays,ISCA)等數(shù)據(jù)庫比對分析,將所檢出CNVs的性質(zhì)分為5類:致病性、可能致病性、意義不明確、可能良性、良性[3-4]。

在經(jīng)過羊水穿刺進(jìn)行染色體核型分析和CMA確診的95例胎兒CNVs中,致病性CNVs占33.68%(32/95),可能致病性CNVs占21.05%(20/95),意義不明確CNVs占41.05%(39/95),可能良性CNVs占4.21%(4/95),無良性CNVs病例。

根據(jù)產(chǎn)前診斷結(jié)果,結(jié)合后續(xù)的超聲篩查,有38例孕婦選擇了優(yōu)生引產(chǎn),其中致病性CNVs引產(chǎn)27例,可能致病性CNVs引產(chǎn)10例,意義不明確CNVs引產(chǎn)1例,無可能良性CNVs和良性CNVs引產(chǎn)病例,見表4。

表4 CNVs的產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局(n)

2.4 對NIPT提示為胎兒CNVs孕婦的隨訪情況

對NIPT提示為胎兒CNVs的224例孕婦進(jìn)行電話或者門診隨訪,其中有31例因拒絕門診就診或就診后電話隨訪不配合導(dǎo)致失訪,隨訪率為86.16%(193/224);但接受羊水穿刺的孕婦隨訪率為100.00%。對于產(chǎn)前診斷結(jié)果CNVs雖然為致病性和可能致病性,但選擇繼續(xù)妊娠的15例孕婦進(jìn)行了隨訪和詳細(xì)記錄,見表5。

表5 產(chǎn)前診斷結(jié)果為致病性和可能致病性CNVs未引產(chǎn)孕婦的妊娠結(jié)局

在致病性CNVs中選擇繼續(xù)妊娠的孕婦共5例,有3例經(jīng)對父母進(jìn)行CMA驗證發(fā)現(xiàn)CNVs來自母源,有2例拒絕驗證,5例新生兒中均未見明顯異常表型。

在可能致病性CNVs中選擇繼續(xù)妊娠的孕婦共10例,有3例經(jīng)對父母進(jìn)行CMA驗證發(fā)現(xiàn)CNVs分別來自父源、母源、新發(fā)突變;驗證為新發(fā)突變的10號病例,新生兒出生后表現(xiàn)為智力低下合并肌張力低,另外2例新生兒中均未見明顯異常表型。10號病例的染色體核型分析及CMA結(jié)果顯示,胎兒在2號染色體2q12.1q14.3區(qū)段存在21.9Mb片段的重復(fù)(見圖1),內(nèi)含BCL2L11(603827)、PAX8(167415)、GLI2(165230)等74個孟德爾(OMIM)基因;該片段內(nèi)包含了累及BCL2L11基因的2q13復(fù)發(fā)性區(qū)域[2q13 recurrent region(includes BCL2L11)]。

注：A為10號病例的染色體核型分析結(jié)果:46,XY,1qh+,dup(2)(q12q14),箭頭表示異常染色體核型位置;B為10號病例的CMA結(jié)果:arr[hg19]2q12.1q14.3(10,2974,221-124,876,241)×3。

在可能致病性CNVs并選擇繼續(xù)妊娠的10例孕婦中,有7例拒絕驗證,1例為孕晚期死胎,1例新生兒出生后表現(xiàn)為智力低下(1號病例),另外5例新生兒中均未見明顯異常表型。1號病例的染色體核型分析及CMA結(jié)果為5號染色體5p15.33p14.2區(qū)帶缺失1個拷貝,長約23Mb(見圖2),該缺失在Decipher數(shù)據(jù)庫中記錄與行為異常、全面發(fā)育遲緩、新生兒張力減退、面容異常、心臟形態(tài)異常、不對稱性身材矮小、認(rèn)知障礙、多發(fā)畸形等有關(guān)。5p部分單體綜合征又稱貓叫綜合征,是最典型的染色體缺失綜合征,是由染色體5p部分或完全缺失引起的。

注：A為1號病例的染色體核型分析結(jié)果:46,XN,del(5)(p14.2p15.3),箭頭表示異常染色體核型位置;B為1號病例的CMA結(jié)果:arr[hg19]5p15.33p14.2(38,139-23,389,253)×1。

3 討論

3.1 NIPT相對于傳統(tǒng)篩查的優(yōu)點

相較于傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查,NIPT對于胎兒染色體疾病篩查方面檢測準(zhǔn)確度更高,檢測范圍更全面,同時因其具有無創(chuàng)、方便、快捷的優(yōu)點,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。隨著新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展,除了胎兒染色體非整倍體等數(shù)目異常外,NIPT還能檢測出胎兒CNVs。目前,對于NIPT胎兒染色體數(shù)目異常方面的研究很多,但關(guān)于NIPT應(yīng)用于胎兒CNVs檢測的報道相對較少[5]。本研究經(jīng)NIPT提示可能為胎兒CNVs的孕婦檢出率為1.05%(224/21 389),與文獻(xiàn)報道[6-10]的NIPT對胎兒CNVs的檢出率為0.175%～1.600%相符。本研究中經(jīng)羊水穿刺產(chǎn)前診斷后得到的陽性預(yù)測值為55.56%(95/171),與丁昭寧等[11]報道的60.0%基本一致。充分肯定了NIPT在胎兒CNVs篩查方面的應(yīng)用價值。

3.2 NIPT檢測結(jié)果的病例分析

隨著NIPT的廣泛應(yīng)用,其檢測范圍從常見的21三體、18三體和13三體等染色體疾病,逐漸擴展到了CNVs的檢測,從而進(jìn)一步減少了染色體疾病胎兒的出生。本研究中的10號病例,羊水穿刺染色體核型分析及CMA結(jié)果顯示,胎兒在2號染色體2q12.1q14.3區(qū)段存在21.9Mb片段的重復(fù),其內(nèi)包含了BCL2L11(603827)、PAX8(167415)、GLI2(165230)等74個孟德爾(OMIM)基因。有研究顯示,在發(fā)育遲緩、畸形等臨床表型患者中檢測到累及BCL2L11基因的2q13區(qū)段的重復(fù),部分患者為遺傳自表型正?；蛘咻p微異常的父母(PMID:21255006,26227573);其中PAX8基因雜合突變與常染色體顯性遺傳的先天性非甲狀腺腫的甲狀腺功能減退2型疾病有關(guān),臨床表型包括不能生長發(fā)育、智力障礙、甲狀腺功能減退等;GLI2基因雜合突變與常染色體顯性遺傳的前腦無裂畸形9型疾病有關(guān),臨床表型包括前腦無裂畸形、垂體發(fā)育不全伴全垂體功能減退、軸后多指畸形等[4]。也有研究顯示,在身材矮小、小頭畸形、短頭畸形、先天性青光眼、智力障礙等臨床表型的患者中檢測到2q11.2q14.2區(qū)段的重復(fù);該病例經(jīng)父母CMA驗證后確定為新發(fā)突變及可能致病性CNVs,隨訪胎兒出生后的臨床表型,與羊水穿刺分析結(jié)果相符[12]。

3.3 NIPT對于CNVs的驗證價值分析

有研究顯示,NIPT對于胎兒CNVs檢出率與母體血漿中cffDNA含量及CNVs片段不同大小密切相關(guān)[13]。本研究中根據(jù)CNVs不同類型分組,NIPT對于微缺失、微重復(fù)、微缺失合并微重復(fù)三組間陽性預(yù)測值分別為56.67%、50.70%、80.00%,其中微重復(fù)組的陽性預(yù)測值最低、微缺失合并微重復(fù)組的陽性預(yù)測值最高,但三組間陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可以認(rèn)為NIPT對于微缺失、微重復(fù)、微缺失合并微重復(fù)三組間的檢測價值方面無區(qū)別,國內(nèi)外文獻(xiàn)中從該角度報道的可查詢文獻(xiàn)較少。本研究中根據(jù)CNVs不同片段分組,NIPT對于>10Mb、5～10Mb、<5Mb三組間陽性預(yù)測值分別為56.76%、60.00%、53.54%,其中<5Mb組的陽性預(yù)測值最低、5～10Mb組的陽性預(yù)測值最高,但三組間陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與張穎等[14]的研究結(jié)果一致。

3.4 NIPT假陰性與假陽性的分析

本研究中進(jìn)行羊水穿刺的171例孕婦,羊水染色體核型分析及CMA確診CNVs共95例,結(jié)果陰性76例。分析NIPT在檢測染色體片段發(fā)生假陽性與假陰性的原因,可能是由于cffDNA濃度過低、限制性胎盤嵌合(1%～2%概率)、母體染色體異常、NIPT測序深度不夠、測序數(shù)據(jù)量不足等因素導(dǎo)致[15-17]。2015年,國際產(chǎn)前診斷學(xué)會(International Society for Prenatal Diagnosis,ISPD)更新了NIPT的檢測指南,提出對于NIPT范圍的擴大應(yīng)當(dāng)限制在研究相對明確的且有異常臨床表型微缺失或者微重復(fù)綜合征,對于NIPT提示可能為CNVs異常的孕婦,必須建議其進(jìn)行規(guī)范的超聲篩查及侵入性產(chǎn)前診斷,以獲取胎兒樣本進(jìn)行確診,對于部分產(chǎn)前診斷結(jié)果還要進(jìn)行父母CMA的驗證。

綜上所述,利用NIPT對于胎兒CNVs進(jìn)行初步篩查是有效且可行的[18-19],特別是對致病風(fēng)險≥5Mb的CNVs[20]。對于有CNVs異常風(fēng)險的胎兒,在經(jīng)產(chǎn)前診斷后應(yīng)及時給予干預(yù),建議終止妊娠。NIPT篩查可以有效地減少侵入性產(chǎn)前診斷的人數(shù),也降低了有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷可能導(dǎo)致的不必要的胎兒丟失風(fēng)險。但要明確的是,NIPT技術(shù)仍然是一項篩查檢測,還需要對其檢測的精準(zhǔn)性進(jìn)行大樣本的臨床驗證,目前還不能完全取代胎兒樣本CMA結(jié)果,不能作為終止妊娠的金標(biāo)準(zhǔn)[21]。本研究中未能對羊水穿刺結(jié)果確診為致病性和可能致病性CNVs的所有胎兒進(jìn)行父母CMA的驗證,且對于新生兒結(jié)局的隨訪結(jié)果主要是電話溝通獲得信息,缺少專業(yè)新生兒科醫(yī)師的規(guī)范診斷,在后續(xù)的研究中需要注意改進(jìn)。