不同產地黃芪質量及其儲藏對成分的影響

李強，吳濤，石榴花，殷濤，王冰清，胡力飛,3

1.勁牌有限公司（黃石 435100）；2.勁牌持正堂藥業有限公司（黃石 435100）；3.湖北工業大學生物工程與食品學院（武漢 430068）

黃芪為豆科植物（Leguminosae）蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，為我國常用的傳統中藥材，以“黃耆”之名始載于《神農本草經》，具有補氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效[1-2]。黃芪可作為保健食品原料使用，在我國有作為食品原料的食用歷史，并于2019年11月開始作為9種試點按照傳統既是食品又是中藥材的物質之一。黃芪中的化學成分主要為皂苷、黃酮和多糖類成分，現代研究表明，黃芪具有提高免疫力[3]、抗腫瘤[4-5]、降血糖[6-7]、降尿酸[8]、抗炎[9]、抗氧化[10-12]、抗疲勞[13-14]等藥理作用。

試驗主要對甘肅省定西市、隴南市及內蒙古包頭市共22批黃芪藥材進行質量評價，根據含量、總灰分、二氧化硫殘留、浸出物、重金屬對不同產地的原料進行聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘分析，并對儲存4年后的藥材黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷成分含量進行比較分析，以期為黃芪的產地選擇、儲存及產品開發提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UltiMate 3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Alltech ELSD 6000（美國奧泰公司）；Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱[安捷倫科技（中國）有限公司]；Sepax Amethyst C18-H色譜柱（美國賽分有限公司）；ICAP RQ電感耦合等離子體質譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；XS-105DU電子分析天平（梅特勒托利多科技有限公司）；SK8200LHC超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；PHOENIX馬弗爐（美國CEM公司）；101-2 AB電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DFY-500 C搖擺式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；藥典篩（浙江上虞五四紗篩廠）。

黃芪甲苷（批號110781-201717，96.90%；批號110781-202118，96.80%；中國食品藥品檢定研究院）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606，97.60%；111920-201907，96.80%；中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜級，美國Fisher chemical公司）；甲酸（色譜級，美國Fisher chemical公司）；水為超純水，其余試劑為分析純。

22批不同產地黃芪藥材，由勁牌持正堂藥業有限公司采集，經鑒定為豆科植物（Leguminosae）蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，藥材產地信息見表1。

表1 黃芪樣品產地信息

1.2 試驗方法

1.2.1 水分測定

取約2 g通過2號藥典篩（篩孔內徑0.850 mm）的黃芪粉末，根據《中國藥典》通則水分測定法第二法測定，并計算供試品中的含水量（%）。

1.2.2 含量測定

采用《中國藥典》2015版及2020版黃芪項下要求進行黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定[1,15]，其中黃芪甲苷測定所用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm），毛蕊異黃酮葡萄糖苷測定所用色譜柱為Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）。黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品及各批次藥材色譜圖如圖1所示。

圖1 22批黃芪樣品及對照品HPLC色譜圖

所有供試品黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均以干燥品計。供試品含量按以下式（1）計算：

1.2.3 總灰分測定

取約2.5 g通過2號藥典篩的黃芪粉末，根據《中國藥典》通則灰分測定法要求進行總灰分測定。

1.2.4 重金屬及有害元素測定

取約0.5 g通過2號藥典篩的黃芪粉末，按照《中國藥典》鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（通則電感耦合等離子體質譜法）采用ICAP RQ電感耦合等離子體質譜儀測定。

1.2.5 二氧化硫的測定

取約10 g黃芪藥材細粉，根據《中國藥典》通則二氧化硫殘留量測定法中第一法（酸堿滴定法）要求進行供試品二氧化硫殘留量測定。

1.2.6 有機氯類農藥殘留量

取2 g通過3號藥典篩（篩孔內徑0.355 mm）的黃芪粉末約，采用《中國藥典》農藥殘留量測定法第一法（其他有機氯類農藥殘留量測定法）測定。

1.2.7 浸出物的測定

取2～4 g通過2號藥典篩的黃芪粉末，根據《中國藥典》通則浸出物測定法中冷浸法要求進行浸出物含量測定。

2 結果與分析

2.1 含量測定方法學確認

分別對《中藥藥典》2015版及2020版黃芪項下黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷開展方法學確認，結果表明測定方法重復性均≤2.8%，中間精密度均≤2.7%，平均回收率均在98%～103%之間，表明儀器方法的精密度及方法的重復性較好，檢測方法適宜性較好。

2.2 黃芪樣品測定結果

試驗按照《中國藥典》2015版黃芪項下要求對黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、水分、總灰分、二氧化硫殘留量、重金屬、有機氯類農藥殘留量及浸出物進行測定，根據檢測結果，22批黃芪樣品中二氧化硫殘留量均未檢出，有機氯類農藥殘留量均符合要求，其他指標含量存在差異，各項指標檢測數據見表2。

表2 22批黃芪樣品檢測結果

2.3 聚類分析（CA）

以黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、總灰分、浸出物和5個重金屬指標作為變量，采用Origin Pro 2023軟件以ward聚類方法結合Euclidean Distance距離計算對22批黃芪樣品進行聚類分析，以ward聚類方法結合Pearson相關性對9個指標變量進行聚類分析，聚類分析結果見圖2。結果表明：判定距離為6時，黃芪樣品可被分為4類，其中定西市與隴南市相鄰的2個產地樣本被分為3類，主要與黃芪甲苷、鉛、砷3個變量有關；內蒙古包頭市樣本（S18～S22）聚為1類。9個變量分別聚為4類，黃芪甲苷與銅聚為1類，總灰分與鉛、砷、鎘聚為1類，浸出物與汞聚為1類，毛蕊異黃酮葡萄糖苷為1類。從聚類熱圖中可見，黃芪原料分類與各變量之間有一定相關性，可能與各種植地區的氣候、土壤等因素有關。

圖2 22批黃芪樣本聚類分析熱圖

2.4 主成分分析（PCA）

采用Origin Pro 2023軟件對黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、總灰分、浸出物和5個重金屬指標進行主成分分析，計算相關矩陣的特征值、特征向量和分值。確定特征值＞1的4個主成分，4個主成分的累計方差貢獻率為81.52%，相關矩陣的特征值所作碎石圖見圖3。第1主成分（PC1）解釋總方差的34.55%，信息主要來自于砷、鉛和總灰分且均呈正相關；第2主成分（PC2）解釋總方差的17.18%，信息主要來自于銅、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，與銅呈正相關，與毛蕊異黃酮葡萄糖苷呈負相關；第3主成分（PC3）解釋總方差的15.77%，信息主要來自于鎘、黃芪甲苷和浸出物，與鎘和浸出物呈正相關，與黃芪甲苷呈負相關；第4主成分來（PC4）解釋總方差的14.02%，信息主要來自于汞和總灰分且均呈正相關。以PC1、PC2、PC3繪制22批次黃芪樣本的雙標圖見圖4，其中內蒙古包頭市樣本空間分布較為集中，甘肅省定西市、隴南市2個地域相近的樣本也分布比較相近，兩省/自治區的樣本能很好區分，且各樣本主成分得分和特征向量的分布情況均與聚類分析結果相近。

圖3 主成分分析碎石圖

圖4 主成分分析雙標圖

2.5 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

采用SIMCA14.1軟件對黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、總灰分、浸出物和5個重金屬指標進行OPLS-DA分析，結果表明，通過OPLS-DA可實現對甘肅和內蒙古兩省黃芪的有效區分，分析中的自變量擬合指數（R2X）為0.692，因變量擬合指數（R2Y）為0.848，模型預測指數（Q2）為0.535，R2和Q2均超過0.5，表明該模型擬合結果可接受。同時通過200次置換檢測，Q2回歸線與縱軸的相交點小于0，說明模型不存在過擬合，所建立的模型有效，該結果可用于黃芪產地對比分析，相關分析結果如圖5和圖6所示。結果表明，OPLS-DA將22批黃芪樣本分為2類，所生成的變量VIP圖如圖7所示，并以VIP大于1為閾值，篩選出3個貢獻值較大的成分，依次為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、銅和砷，判斷其為區分甘肅、內蒙古樣本的代表性差異成分。成分差異可能與藥材的種植環境的不同相關。

圖5 OPLS-DA得分圖

圖6 OPLS-DA模型置換驗證圖

圖7 OPLS-DA模型VIP值

2.6 儲藏對藥材含量的影響

中藥材成分往往根據性質的不同會隨儲藏時間、條件而變化，試驗對采用聚乙烯袋密封儲存于陰涼條件下的22批儲存時間為4年的黃芪樣本中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量進行測定（見表3），其中黃芪甲苷指標采用《中國藥典》2015版和2020版2種檢測方法（兩者色譜條件相同，但供試品溶液處理方法不同）。結果表明，儲存4年前后毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量根據產地批次的不同有較大的變化差異，含量均有所下降（10.3%～87.1%），平均下降約45.9%，其中共有5批次不符合《中國藥典》要求；而黃芪甲苷指標含量變化較小，雖然部分批次藥材存在含量差異，但兩者均值非常相近；黃芪甲苷因《中國藥典》不同版次檢測方法的差異而含量結果有所差異，2015版含量測定結果相對較小，可能與供試品制備過程中采用萃取及樹脂分離工序有關。以《中國藥典》2015版黃芪指標成分測定結果對儲藏前后的成分含量對比情況如圖8所示，黃芪在長期儲藏過程中需要關注毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量變化情況。

圖8 黃芪儲藏前后指標成分含量對比情況

表3 22批黃芪藥材儲藏4年后含量情況

3 結論

試驗采集甘肅省定西市、隴南市及內蒙古自治區包頭市共6個縣/旗22批黃芪樣品，并根據《中國藥典》要求對黃芪各項指標進行測定，其中各樣品均為原料直接采集，二氧化硫、有機氯類農藥殘留量均為符合《中國藥典》要求，水分用于黃芪甲苷、毛蕊異黃酮含量計算，因此選擇黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、總灰分、浸出物和5個重金屬共9個指標變量進行化學計算學分析。通過聚類分析，22個樣本及9個變量指標均被分為4類，原料的分類與變量之間有一定相關性；而主成分分析共提取4個主成分，內蒙古包頭市樣本空間分布較為集中，甘肅省定西市、隴南市2個地域相近的樣本也分布相近，兩省/自治區的樣本能實現較好區分，各樣本得分的分布情況和特征向量與聚類分析結果相似，特征向量也與變量聚類分析結果相近；同時，通過OPLS-DA可實現對甘肅和內蒙古兩省黃芪的有效區分，篩選出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、銅和砷為甘肅、內蒙古樣本的代表性差異成分；成分差異可能與藥材的種植環境的不同相關。

黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷2個指標成分在黃芪儲藏過程中的變化趨勢存在差異，黃芪甲苷在儲藏前后含量變化較小，而毛蕊異黃酮葡萄糖苷根據產地批次的不同變化差異較大（含量下降10.3%～87.1%），且有5個批次已不符合《中國藥典》要求。因此，在黃芪原料工業生產過程中，需對儲藏過程毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量變化情況加以關注。