UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中7種丁香酚類(lèi)麻醉劑殘留量

陳源

譜佳生命科技（福州）有限公司（福州 350028）

丁香酚類(lèi)化合物（丁香酚、異丁香酚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚、乙?；惗∠惴拥龋┚哂新樽?、抑菌、抗氧化等多種藥理作用[1-2]。相對(duì)于其他魚(yú)用麻醉劑具有成本低、效果好[3]且殘留期短[4]的特點(diǎn)。然而，有研究表明丁香酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)肝臟具有一定毒性[5-6]，且美國(guó)和世界癌癥研究機(jī)構(gòu)丁香酚是可疑致癌物并將丁香酚列為第3類(lèi)致癌物[7]。丁香酚類(lèi)在我國(guó)可作為牙科診療劑、化妝品和食品添加劑使用，但在鮮活水產(chǎn)領(lǐng)域中尚無(wú)明確規(guī)定。

關(guān)于丁香酚類(lèi)化合物的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[8]、紫外分光光度法[9]、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法[10]、氣相色譜法[11]、液相色譜法[12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。分光光度法測(cè)不僅溶劑消耗大且靈敏度較低；薄層色譜法定性定量不準(zhǔn)確，且溶劑易揮發(fā)對(duì)人體傷害大；化學(xué)發(fā)光酶免疫成本高，不適合批量檢測(cè)；色譜法在分離性、選擇性和靈敏度具有較高的分析能力，但需要較長(zhǎng)且復(fù)雜的前處理，并容易受到干擾需進(jìn)一步的確認(rèn)，已無(wú)法滿(mǎn)足批量檢測(cè)的要求。近年來(lái)，色譜結(jié)合質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在分析上具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好、定性定量更準(zhǔn)確等特點(diǎn)而被廣泛使用。

試驗(yàn)利用同位素內(nèi)標(biāo)-超高相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)，該方法檢測(cè)時(shí)不僅檢測(cè)限和定量限低，而且擁有較好的準(zhǔn)確性，操作步驟簡(jiǎn)便，滿(mǎn)足水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)的殘留測(cè)定，以期能為水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)殘留的測(cè)定提供有效數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試樣制備

魚(yú)類(lèi)，去頭、骨、內(nèi)臟，取肌肉等可食部位絞碎混合均勻，在-18 ℃以下冷凍保存，備用。

1.2 儀器及試劑

1290型超高效液相色譜-6470型三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及MassHunter 10.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司）；丁香酚、異丁香酚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙?；惗∠惴雍烷g氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；低速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；多管渦旋混勻儀（逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和乙酸銨均為分析純或色譜純（安譜科技有限公司）；HLB固相萃取柱（300 mg/6 mL，逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

丁香酚類(lèi)麻醉劑的儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取丁香酚類(lèi)化合物于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液。在-20 ℃下避光保存，有效期2個(gè)月。分別移取適量的體積標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別移取適量體積混標(biāo)中間液用25%（V/V）甲醇-水溶液稀釋成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）勻漿后的樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入25 μL丁香酚-d3（10.0 μg/mL）溶液，渦旋混勻，靜置20 min。加入5 mL乙腈，渦旋振蕩提取10 min后，在4000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，用5 mL乙腈溶液重復(fù)提取殘?jiān)?次，合并上清液于15 mL離心管中。將合并后的上清液離心5 min，取上清液加載到HLB 6 mL小柱上（使用前用5 mL乙腈活化），收集流出液，并用2 mL乙腈進(jìn)行洗脫，將流出液收集于15 mL離心管中，常溫下氮吹至近干，用0.5 mL 25%（V/V）甲醇-水溶液溶液復(fù)溶，0.22 μm濾膜，取上清液供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.5 儀器條件

色譜條件：ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相A為4 mmol/L乙酸銨水溶液（0.1%甲酸），流動(dòng)相B為甲醇；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：ESI源，正離子模式，毛細(xì)管電壓3.5 kV，離子源溫度350 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，噴霧壓強(qiáng)35 psi，脫溶劑氣流量12 L/min，離子監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 化合物丁香酚的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

表3 鯧魚(yú)中丁香酚類(lèi)麻醉劑的加標(biāo)回收率和精密度

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度1 mg/L的7種丁香酚類(lèi)混標(biāo)溶液自動(dòng)進(jìn)樣，在MS1Scan模式同時(shí)以正、負(fù)離子模式在m/z100～250范圍進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描。結(jié)果表明，丁香酚和異丁香酚在負(fù)離子模式下信號(hào)較強(qiáng)，分析兩個(gè)化學(xué)的結(jié)構(gòu)式可看出兩者含有酚羥基易丟失一個(gè)質(zhì)子形成[M-H]-。另外5種化合物不含酚羥基且結(jié)構(gòu)式中的C＝O的O或——NH2中的N有孤對(duì)電子，能接受H+而呈現(xiàn)正離子的形式，故在正離子的模式下響應(yīng)最大。由此，確定7種化合物的準(zhǔn)分子離子（母離子），選擇MS1SIM模式，以各分子離子響應(yīng)最大化優(yōu)化碎裂電壓，確定7種化合物的碎裂電壓。選擇Product Scan模式，分別設(shè)定各母離子的碰撞能5，10，20，30和40 eV，進(jìn)行掃描，從7種化合物的二級(jí)質(zhì)譜中分別選取2個(gè)離子對(duì)豐度比較強(qiáng)的碎片離子且無(wú)干擾，將相對(duì)豐度最強(qiáng)的碎片離子作為定量離子對(duì)，次強(qiáng)的碎片離子與母離子作為定性離子對(duì)。選擇MRM模式，分別優(yōu)化每對(duì)離子對(duì)的碰撞能，確定最優(yōu)值，譜圖和離子質(zhì)譜圖詳見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 7種化合物的總離子流圖

圖2 7種化合物的離子質(zhì)譜圖

2.2 固相萃取柱的優(yōu)化

丁香酚類(lèi)的極性大小差異較大，根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道乙腈在提取過(guò)程中具有較高的提取效率，試驗(yàn)參照文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果選取空白明蝦樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果滿(mǎn)足檢測(cè)的要求。由于水產(chǎn)品含有大量脂溶性基質(zhì)，若直接進(jìn)樣不僅會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，且對(duì)儀器污染較大而加大維護(hù)成本，因此提取的溶液需進(jìn)行凈化處理。根據(jù)7種丁香酚類(lèi)物質(zhì)的性質(zhì)，比較HLB小柱和C18小柱的凈化效果，以陰性鯧魚(yú)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)（加標(biāo)水平10 μg/kg）評(píng)判試驗(yàn)的結(jié)果，上樣后以2 mL乙腈洗脫固相萃取柱，其余步驟按1.4節(jié)進(jìn)行，進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。結(jié)果表明，采用HLB柱凈化時(shí)，7種丁香酚類(lèi)物質(zhì)平均回收率均較好，在87.3%～106.7%之間，且雜質(zhì)干擾少，而采用C18柱凈化時(shí)，乙酸丁香酚酯的回收率較低且基線(xiàn)噪音比較大。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 方法的線(xiàn)性范圍、檢出限、定量限與基質(zhì)效應(yīng)

在1.0～100 μg/L的基質(zhì)匹配曲線(xiàn)，7種麻醉劑在線(xiàn)性范圍內(nèi)良好，相關(guān)系數(shù)均R2＞0.99。以3倍信噪比計(jì)算7種麻醉劑的檢出限（SLOD）和10倍信噪比計(jì)算定量限（SLOQ）。7種麻醉劑的檢出限0.01～0.03 μg/kg，定量限0.05～0.1 μg/kg。對(duì)于水產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，使目標(biāo)物產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或者抑制效應(yīng)主要是脂肪類(lèi)的雜質(zhì)，可按式（1）計(jì)算。結(jié)果顯示，丁香酚和異丁香酚表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其他5種麻醉劑表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。

式中：A為基質(zhì)中分析物的響應(yīng)值；B為純?nèi)軇┲蟹治鑫锏捻憫?yīng)值。ME=0.8～1.2時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；反之，為中強(qiáng)等基質(zhì)效應(yīng)[15]。

2.3.2 回收率及精密度

試驗(yàn)方法采用鯧魚(yú)樣為基質(zhì)，進(jìn)行3個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平為6個(gè)平行的加標(biāo)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，丁香酚類(lèi)麻醉劑的回收率范圍為78.4%～118%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2.5%～8.3%。試驗(yàn)方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均達(dá)標(biāo)。由此可見(jiàn)，該方法的準(zhǔn)確性和精密度較好。并將方法對(duì)黑魚(yú)和黃甲魚(yú)進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明回收率（75.6%～109%）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（2.6%～9.8%），也符合痕量分析的要求。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

調(diào)查福建省市售的101份水產(chǎn)品樣品，主要涉及種類(lèi)有黑魚(yú)、黃甲魚(yú)、烏魚(yú)、鱖魚(yú)等。其中，超出定量限24份，檢出的目標(biāo)物是丁香酚，檢出范圍為0.0028～0.40 mg/kg。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立一種快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的檢測(cè)方法，采用UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中的7種麻醉劑。該方法具有較好的相關(guān)線(xiàn)性（R2＞0.99），精密度高（SRSD＜20%），回收率好（78.4%～118%）。采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法，共對(duì)101份水產(chǎn)品進(jìn)行分析。其中，超出定量限24份，涉及麻醉劑為丁香酚，表明需對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行更頻繁的監(jiān)測(cè)，以確保麻醉劑殘留保持在一定范圍內(nèi)或減少。