頂空固相微萃取法分析葡萄蒸餾酒香氣中酯類成分差異

朱捷，何微, ，高琳，李瑞雪，鄭國(guó)濤

1.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院（銀川 750002）；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)（南京 210095）；3.寧夏鎮(zhèn)北堡酒業(yè)有限責(zé)任公司（銀川 750026）

葡萄蒸餾酒作為葡萄及葡萄酒的深加工產(chǎn)品，以其獨(dú)具特色的口味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，吸引眾多消費(fèi)者，它是以葡萄為原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成的飲料酒[1]。葡萄蒸餾酒雖然與傳統(tǒng)白酒一樣，有著較高的酒精度，含有多種酯類，但又區(qū)別于傳統(tǒng)釀造的糧食白酒[2-3]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)研究，構(gòu)成葡萄蒸餾酒的香氣成分有500余種[4]，主要包括酯類、醇類、酸類、萜烯類、醛酮類等[5-6]化合物。這些化合物的組成和含量受葡萄品種、種植產(chǎn)區(qū)、栽培模式和葡萄采收期等[7-11]因素的影響，其中葡萄品種被認(rèn)為是影響葡萄蒸餾酒香氣成分最主要的因素[12]。周洪江等[13]研究煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)以“白玉霓”“赤霞珠”“蛇龍珠”3種釀酒葡萄為原料釀造的葡萄蒸餾酒中香氣成分，找到26種酯類物質(zhì)，占香氣成分的46.75%～63.39%，研究發(fā)現(xiàn)不同品種的蒸餾酒中酯類物質(zhì)種類及含量各不相同，且具有各自特點(diǎn)，其中壬酸乙酯是白玉霓的特征酯類。王鑫等[14-15]對(duì)比研究楊凌地區(qū)“霞多麗”“愛(ài)格麗”“小芒森”等5個(gè)品種葡萄蒸餾酒的香氣成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“愛(ài)格麗”蒸餾酒香氣更為濃郁，對(duì)其香氣貢獻(xiàn)最大的主要是乙酯類成分。曹佩佩[16]分析“夏黑”“戶太八號(hào)”“黃玫瑰”“巨玫瑰”“摩爾多瓦”5個(gè)鮮食品種蒸餾酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“巨玫瑰”蒸餾酒中醇類物質(zhì)含量與酯類含量相近，其他蒸餾酒中醇類物質(zhì)含量均明顯高于酯類物質(zhì)含量，其中“摩爾多瓦”蒸餾酒中醇類物質(zhì)總量占比最高達(dá)61.20%，“戶太八號(hào)”“黃玫瑰”“巨玫瑰”“愛(ài)格麗”蒸餾酒中酸類物質(zhì)含量較多且相近。

酯類物質(zhì)是葡萄蒸餾酒香氣成分中的主要成分，也是反映葡萄蒸餾酒品質(zhì)的重要參考，要進(jìn)行分析就必須將酯類成分提取濃縮和分離檢測(cè)。GC-MS是分析酒精飲料揮發(fā)性物質(zhì)最常見(jiàn)的方法[17-18]，而頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME）作為固相微萃取的一種，其具有效率高，自動(dòng)化程度高、可多平臺(tái)聯(lián)用等優(yōu)勢(shì)，在揮發(fā)性成分富集分析中具有明顯的優(yōu)勢(shì)[19-20]，但在HS-SPME使用過(guò)程中萃取溫度、萃取時(shí)間、解吸時(shí)間、平衡時(shí)間等因素都影響著酯類物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果，而對(duì)于這部分的研究較少。

綜合而言，不同品種葡萄對(duì)生產(chǎn)出的葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)的影響研究得還不夠深入，且鮮見(jiàn)關(guān)于賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)的報(bào)道和研究。試驗(yàn)以賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄“赤霞珠”“蛇龍珠”“美樂(lè)”“西拉”“黑比諾”為原料生產(chǎn)的葡萄蒸餾酒為研究對(duì)象，優(yōu)化HS-SPME萃取條件，通過(guò)HSSPME與GC-MS聯(lián)用的方法，比較其香氣成分中酯類物質(zhì)的差異，以期為賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄蒸餾酒品質(zhì)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料概況

葡萄蒸餾酒由寧夏鎮(zhèn)北堡酒業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，該公司所用葡萄原料均采自于賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)（2022年），分別為“赤霞珠”“蛇龍珠”“美樂(lè)”“西拉”“黑比諾”5種釀酒葡萄，采用塔式蒸餾器進(jìn)行蒸餾，酒精度均為56%vol。

1.2 試劑

NaCl（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；3-辛醇（99.7%，壇墨質(zhì)檢標(biāo)物中心）。

1.3 儀器與設(shè)備

7890B-7000C氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；PAL全自動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)（瑞士CTC公司）；DVB/CAR/PDMS一體化萃取進(jìn)樣針（瑞士CTC公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理

取葡萄蒸餾酒樣品，用超純水將樣品稀釋至酒精度15%vol后準(zhǔn)確吸取8 mL，加入帶有聚四氟乙烯密封蓋的頂空進(jìn)樣瓶中，加入0.1 g/mL NaCl，密封小瓶。

1.4.2 氣相色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-WAX UI氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣為高純氦氣（He）；不分流進(jìn)樣；流速1 mL/min。升溫程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至170 ℃，保持8 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持11 min。

EI離子源：電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度240 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～500 amu。

萃取針為DVB/CAR/PDMS型。

1.4.3 HS-SPME萃取條件優(yōu)化

取同種待測(cè)樣品，按照1.4.1步驟處理樣品，以分離得到酯類物質(zhì)色譜峰的總峰面積和峰個(gè)數(shù)為參考指標(biāo)，對(duì)不同萃取溫度（25，30，35，40，45，50，55和60 ℃）、不同平衡時(shí)間（0，5，10，15，20，25，30和35 min）、不同萃取時(shí)間（10，20，30，40，50，60和70 min）、不同解吸時(shí)間（1，3，5，7和9 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.4 定性與定量分析

試樣制備方式按1.4.1中步驟進(jìn)行，并加入40 μL、500 μg/mL的3-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液，根據(jù)優(yōu)化后的條件設(shè)置固相微萃取參數(shù)。

定性分析：將GC-MS檢測(cè)的化合物質(zhì)譜圖與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）普庫(kù)Ⅱ進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)。

定量分析：使用安捷倫MassHunter定量分析軟件，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算酯類物質(zhì)的相對(duì)含量，按式（1）計(jì)算。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Excel 2016、SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用P=0.05的顯著性水平，Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溫度的選擇

按1.4.1的步驟進(jìn)行，設(shè)置固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)平衡時(shí)間20 min、萃取時(shí)間30 min、解吸時(shí)間5 min、振搖頻率10 s/min。在此條件下考察不同萃取溫度（25，30，35，40，45，50，55和60 ℃）對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果表明，隨著萃取溫度的增加，提取出的酯類物質(zhì)也隨之增加，35 ℃時(shí)酯類物質(zhì)的個(gè)數(shù)及峰面積最大，因?yàn)檩腿囟鹊纳邥?huì)加速分子熱運(yùn)動(dòng)，提高揮發(fā)性化合物的遷移率。但繼續(xù)提高萃取溫度后，酯類物質(zhì)的個(gè)數(shù)及峰面積反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于在頂空瓶的有限空間內(nèi)，揮發(fā)性物質(zhì)不斷增加，低沸點(diǎn)物質(zhì)因高沸點(diǎn)組分的競(jìng)爭(zhēng)吸附而減少，降低在萃取纖維上的分配系數(shù)[21-22]，這個(gè)變化趨勢(shì)也與趙馨馨等[23]、孫麗君等[1]的研究結(jié)果一致。因此選擇35 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 平衡時(shí)間的選擇

平衡時(shí)間是在萃取纖維接觸揮發(fā)性成分之前，待測(cè)成分在頂空和樣品之間達(dá)到平衡所需時(shí)間。試驗(yàn)按1.4.1中步驟進(jìn)行，旋緊瓶蓋。設(shè)置固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)萃取溫度35 ℃、萃取時(shí)間30 min、解吸時(shí)間5 min、振搖頻率10 s/min。在此條件下考察不同平衡時(shí)間（0，5，10，15，20，25，30和35 min）對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 平衡時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

結(jié)果表明，隨著平衡時(shí)間的增加，酯類物質(zhì)也隨之增加，平衡時(shí)間25 min時(shí)，酯類物質(zhì)的個(gè)數(shù)及峰面積最大，因此確定平衡時(shí)間為25 min。

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇

萃取時(shí)間是從萃取纖維與試樣接觸到吸附平衡所需要的時(shí)間。試驗(yàn)按1.4.1中步驟進(jìn)行，旋緊瓶蓋。設(shè)置固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)萃取溫度35 ℃、平衡時(shí)間25 min、解吸時(shí)間5 min、振搖頻率10 s/min。在此條件下考察不同萃取時(shí)間（10，20，30，40，50，60和70 min）對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

結(jié)果表明，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品組分不斷的富集在萃取纖維中，萃取50 min后，峰面積達(dá)到最大值，隨著萃取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，富集的速度越來(lái)越慢，總峰面積趨于穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)萃取纖維已接近平衡狀態(tài)。萃取時(shí)間不斷增加，被檢測(cè)出的酯類物質(zhì)的個(gè)數(shù)變化不明顯，均在17～20個(gè)之間，綜合2個(gè)結(jié)果，選取50 min為最佳萃取時(shí)間。

2.1.4 解吸時(shí)間的選擇

試驗(yàn)按1.4.1中步驟進(jìn)行，旋緊瓶蓋。設(shè)置固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)萃取溫度35 ℃、平衡時(shí)間25 min、萃取時(shí)間50 min、振搖頻率10 s/min。在此條件下考察不同解吸時(shí)間（1，3，5，7和9 min）對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 解吸時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

結(jié)果表明，隨著解吸時(shí)間的增加，酯類物質(zhì)出峰個(gè)數(shù)及總峰面積增加，解吸5 min后達(dá)到最大值，但繼續(xù)增加解吸時(shí)間，酯類物質(zhì)個(gè)數(shù)及峰面積呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢(shì)，但解吸9 min后，酯類物質(zhì)峰形明顯變差。這是因?yàn)樵谕粶囟认拢馕鼤r(shí)間與揮發(fā)性組分從萃取纖維解吸附的程度密切相關(guān)，解吸時(shí)間較短會(huì)造成目標(biāo)物解吸附不完全，而解吸時(shí)間長(zhǎng)會(huì)也會(huì)影響出峰個(gè)數(shù)、峰面積及峰形，還會(huì)降低萃取頭使用壽命，因此選取5 min為最佳解吸時(shí)間。

2.2 葡萄蒸餾酒香氣中酯類物質(zhì)分析結(jié)果

采用優(yōu)化后的HS-SPME條件對(duì)5個(gè)品種葡萄蒸餾酒香氣中酯類物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)含量豐富，共檢測(cè)出酯類26種，但5個(gè)品種的葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)的種類及相對(duì)含量差異顯著。

表1 不同品種葡萄蒸餾酒中酯類成分GC-MS分析結(jié)果

5種葡萄蒸餾酒中共有的酯類為乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、己酸異戊酯、乳酸異戊酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸異戊酯、乙基異戊基琥珀酸酯共15種。其中辛酸乙酯的含量最高，“赤霞珠”“蛇龍珠”“美樂(lè)”“黑比諾”4種葡萄蒸餾酒差異不顯著，均占酯類物質(zhì)總量的40%以上。其次按含量大小依次為丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯，這5種酯類與辛酸乙酯占各類葡萄蒸餾酒中總酯的95%以上。

按葡萄品種來(lái)看，“赤霞珠”葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)較為豐富，其乙酸異戊酯、己酸異戊酯、癸酸乙酯、辛酸異戊酯、水楊酸甲酯、乙酸苯乙酯和月桂酸乙酯的含量較高且與其他四種葡萄蒸餾酒差異顯著，而丁二酸二乙酯的含量卻較低。此外，“赤霞珠”葡萄蒸餾酒中含有少量棕櫚酸乙酯，而這種酯類物質(zhì)在其他品種葡萄蒸餾酒中則基本未檢出。“蛇龍珠”“美樂(lè)”“黑比諾”“西拉”葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)含量較為相似，其中“美樂(lè)”葡萄蒸餾酒中含有少量的戊酸乙酯和丙酸異戊酯，這2種酯類是在其他幾種葡萄蒸餾酒中少見(jiàn)的，與此同時(shí)該葡萄蒸餾酒中又未檢出乙基-9-癸烯酸酯和水楊酸甲酯。從檢測(cè)結(jié)果可以看出，不同品種葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)含量及種類差異較大，正因如此，也造就葡萄蒸餾酒不同風(fēng)味和口感。

3 討論

3.1 固相微萃取條件的優(yōu)化

固相微萃取是集合萃取吸附、頂空進(jìn)樣的一種技術(shù)，萃取溫度、萃取時(shí)間、解吸時(shí)間、平衡時(shí)間等因素都對(duì)結(jié)果有較大影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用的萃取條件多集中于整體香氣成分的檢測(cè)[1,18,23,25]，沒(méi)有專門(mén)針對(duì)酯類物質(zhì)的條件參數(shù)，在試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)比發(fā)現(xiàn)，將蒸餾酒稀釋至酒精度15%vol后測(cè)定揮發(fā)性酯類香氣物質(zhì)的成分，可以避免過(guò)高酒精度導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)的影響，這也與孫麗君等[1]、成池芳等[2]的研究結(jié)果相近。但在NaCl添加量的優(yōu)化上，試驗(yàn)與其他香氣成分的研究[1,8]不同，添加0.1 g/mL NaCl時(shí)酯類物質(zhì)出峰個(gè)數(shù)及總峰面積就達(dá)到最大值，因?yàn)镹aCl的添加可以影響揮發(fā)性組分在氣液兩相的平衡，向液體樣品中添加NaCl溶液有助于酯類物質(zhì)的檢出，但NaCl含量過(guò)高時(shí)，基質(zhì)黏度增加，揮發(fā)性組分?jǐn)U散速度降低[24]。因此，選取添加0.1 g/mL NaCl進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。此外，探討不同萃取針對(duì)酯類物質(zhì)檢出的影響，研究發(fā)現(xiàn)采用PDMS萃取針僅僅富集得到5種酯類物質(zhì)，且總峰面積明顯低于復(fù)合纖維的萃取針，其富集的酯類分別為己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯及月桂酸乙酯。DVB/PDMS萃取針則在該基礎(chǔ)上多富集部分酯類物質(zhì)。對(duì)比3種萃取針可以看出，DVB/CAR/PDMS萃取針對(duì)于葡萄蒸餾酒香氣中酯類物質(zhì)的萃取效率明顯高于其他兩種萃取針，因此選擇DVB/CAR/PDMS萃取針進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 不同產(chǎn)區(qū)葡萄蒸餾酒香氣中酯類物質(zhì)差異

傳統(tǒng)糧谷類蒸餾酒中以乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯占主要地位，而葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)含量及組成則大不相同，這使得葡萄蒸餾酒的風(fēng)味區(qū)別于傳統(tǒng)蒸餾酒。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)以辛酸乙酯的含量最高，丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯含量次之，這個(gè)結(jié)果也與其他產(chǎn)區(qū)的葡萄蒸餾酒有所區(qū)別[13-16,25]，如：周洪江等[13]研究煙臺(tái)地區(qū)3種葡萄品種原白蘭地發(fā)現(xiàn)，癸酸乙酯含量最高，己酸乙酯及辛酸乙酯含量次之，其中“白玉霓”葡萄蒸餾酒中含有較高的壬酸乙酯；王鑫等[14]發(fā)現(xiàn)楊凌地區(qū)主要葡萄蒸餾酒的香氣成分中辛酸乙酯、癸酸乙酯含量最高，兩者約占酯類總量的70%以上，其次還檢出較高含量的正己酸乙酯及乙酸乙酯；趙馨馨等[23]發(fā)現(xiàn)新疆石河子地區(qū)葡萄蒸餾酒中月桂酸乙酯含量很高，僅次于癸酸乙酯；孫麗君等[1]發(fā)現(xiàn)河南地區(qū)葡萄蒸餾酒中丁二酸二乙酯含量很低，這與賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的葡萄蒸餾酒差異較大。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)影響HS-SPME結(jié)果的各種條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳萃取條件：選擇DVB/CAR/PDMS萃取纖維，樣品酒精度15%vol，添加0.1 g/mL NaCl，萃取溫度35 ℃，平衡時(shí)間25 min，萃取時(shí)間50 min，解吸時(shí)間5 min。采用優(yōu)化后的條件分析賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄蒸餾酒，共鑒定出26種酯類物質(zhì)，辛酸乙酯含量最高，其次為丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯，這6種酯類物質(zhì)占各類葡萄蒸餾酒中總酯的95%以上，不同品種葡萄蒸餾酒中酯類物質(zhì)的種類及含量各不相同。試驗(yàn)不但為葡萄蒸餾酒生產(chǎn)選料提供參考，也為后續(xù)賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)與其他產(chǎn)區(qū)葡萄蒸餾酒香氣成分差異的研究提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。