超高相液相色譜串聯質譜法分析雞蛋中金剛乙胺含量殘留

林柯璐 ，王玲，舒暢 ，潘志明

1.德陽市食品藥品安全檢驗檢測中心（德陽 618000）；2.德陽市食品檢驗重點實驗室（德陽 618000）；3.德陽市羅江區糧食質量安全監督檢查站（羅江 618500）

金剛乙胺是最早用于治療流感的人用抗病毒類藥物[1]，曾被廣泛應用于家禽養殖[2]。移植獸用缺乏科學規范、安全有效試驗數據。人類食用金剛乙胺超標的蛋類，對孕婦、哺乳期婦女、老年人可能會造成不良反應。為此，國家明確禁止在動物養殖過程中使用金剛乙胺。然而，由于金剛乙胺合成路線簡單、成本低廉，其在畜禽養殖中被違法投喂現象仍時有發生。由此可見，對于雞蛋中金剛乙胺殘留含量的檢測具有重要現實意義。

我國對于雞蛋中金剛乙胺殘留含量的檢測方法多采用高效液相色譜法及液相色譜-串聯質譜法[3-11]。高效液相色譜法抗干擾能力差，易受基質效應影響，且容易出現假陽性而液相色譜-串聯質譜法具有高效分離和多組分定性、定量的優點，因此成為近年獸藥殘留檢測方法研究的主要方法[12]，常用的標準有SN/T 4253—2015《出口動物組織中抗病毒類藥物殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法》[13]和農業農村部483號公告-6-2016[14]。試驗從提取液、凈化方式等方面優化雞蛋樣品前處理方法，結合UPLC-MS/MS，采用內標法建立雞蛋中金剛乙胺殘留檢出方法，為禽蛋產品的質量安全監管提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6460液質聯用儀（美國安捷倫科技公司）；MS205DU電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；MTN-5800A氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；VG3 S025渦旋振蕩器（德國IKA公司產品）；TGL-16A臺式高速冷凍離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

金剛乙胺、美金剛-d6標準品（壇墨質檢，100 μg/mL）；乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，德國默克公司）；甲酸（優級純，成都科隆化學品有限公司）；乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯乙酸（分析純，北京化工廠）；固相萃取小柱（美國安捷倫科技公司）；尼龍微孔濾膜（天津津騰公司實驗設備有限公司）；實驗室用水為超純水。生鮮雞蛋購于超市和農貿市場。

1.2 標準溶液配制

配制金剛乙胺標準中間溶液（100 ng/mL）：精密量取100.0 μL金剛乙胺標準溶液，置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，于-18 ℃避光保存。

配制美金剛-D6內標工作溶液（100 ng/mL）：精密量取100.0 μL美金剛-D6標準溶液，置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，于-18 ℃避光保存。

分別吸取0.1，0.2，0.5，1.0和2.0 mL標準中間液至10 mL容量瓶中，分別加入0.20 mL美金剛-D6內標工作液，用初始比例流動相稀釋定容至刻度線，得到1，2，5，10和20 ng/mL的系列標準工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 采樣和試樣制備

取超市和農貿市場上購買的雞蛋，采用四分法縮減取200 g，使用料理機進行粉碎均質，裝入自封盒中，冷藏避光，備用。

1.3.2 提取

稱取2 g（精確至0.01 g）均勻樣品至50 mL離心管中，準確加入100 μL內標工作液，加入10 mL 1%乙酸-乙腈（V/V），渦旋30 s，超聲振蕩提取20 min，按8000 r/min離心5 min，上清液全部轉移至50 mL離心管中；加入10 mL的1%乙酸-乙腈（V/V）重復提取1次，合并全部提取液，待凈化。

1.3.3 凈化

取上述全部乙腈層提取液加入已用5 mL甲醇和5 mL水活化的PCX柱中，分別用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，棄去全部流出液，用真空泵減壓抽干，用6 mL 5%氨水甲醇洗脫并接收，于45 ℃氮吹濃縮后采用1 mL 0.1%甲酸水溶液-甲醇（10+90，V/V）定容。過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜-串聯質譜分析。

1.4 色譜條件

色譜柱采用Zorbax Eclipse Plus-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為甲醇；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 洗脫條件

1.5 質譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；多反應監測（MRM）；毛細管電壓4.5 kV；霧化器壓力40 psi；干燥氣流速11 L/min；干燥氣溫度300 ℃；其他質譜條件見表2。

表2 金剛乙胺、美金剛-D6的質譜參數

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 不同提取溶液提取效果的比較

金剛乙胺含有極性氨基基團，易溶于極性有機溶劑，酸性條件更有利于其解離提取。雞蛋富含蛋白質、磷脂等，采用乙腈作為提取溶劑有利于蛋白質的沉淀，降低基質干擾，三氯乙酸也有助于蛋白質變性沉淀。參考SN/T 4253—2015《出口動物組織中抗病毒類藥物殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法》[13]、農業農村部2483號公告-6-2016[14]及文獻[3,6-7,9,11]，試驗通過空白樣品加標（加標量10 μg/kg）方式，比較表3中8種不同提取液對目標化合物的提取回收率。結果表明，純溶劑提取時回收率較差。向溶劑中加入酸可以提高回收率，而加入乙酸的效果優于甲酸。因此，選擇1%乙酸乙腈作為萃取液。

表3 不同提取溶劑對金剛乙胺化合物的提取率

2.1.2 不同凈化方式的選擇

試驗采用空白樣品加標（加標量10 μg/kg）方式比較不同陽離子固相萃取柱對于目標物提取液的凈化效果，其回收率如圖1所示。研究發現，PCX柱回收效果最好，因此選擇PCX柱為凈化柱。

圖1 不同固相萃取柱凈化下金剛乙胺的提取回收率圖

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相的選擇

試驗對比乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-1%甲酸水、乙腈-1%甲酸水6種流動相體系對金剛乙胺10 ng/mL標準溶液的分離效果。單獨采用甲醇-水、乙腈-水作為流動相，結果發現色譜響應一般，色譜峰形較寬[4]。由于金剛乙胺含有氨基，向流動相中加入適量酸能促進離子化效應并提高響應值[16]，因此在水相中加入適量的甲酸。對比0.1%甲酸水和1%甲酸水溶液，0.1%甲酸水溶液作為水相，峰型及峰寬更好。而有機相選擇乙腈時的出峰時間比甲醇作為有機相的出峰時間快，較早出峰可能會有干擾[10]。因此采用體積分數0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動相。在最佳試驗條件下金剛乙胺的色譜圖和特征離子色譜圖如圖2和圖3所示。

圖2 金剛乙胺色譜圖

圖3 金剛乙胺特征離子色譜圖

2.2.2 柱溫的選擇

分別選擇柱溫25，30，35和40 ℃，考察金剛乙胺的出峰效果。結果表明，在其他條件不變時，改變柱溫色譜峰響應與保留時間沒有明顯變化，但柱溫較高時，流動相的溶解度增大，柱壓明顯降低。考慮到色譜柱使用壽命，采用柱溫40 ℃，與葛曉曉等[3]得出結論一致。

2.3 基質效應

基質效應是液質檢測過程中常常碰到的問題，目標化合物在霧化過程中由于基質成分復雜，受到干擾，易產生抑制或增強的效果，使得分析結果出現偏離。同位素內標法因其性質與目標物相似，受基質影響程度相同，是液質聯用分析中常采用的降低基質效應、提高定量準確性的一種方法[13]。試驗選擇美金剛-D6作為金剛乙胺同位素內標物，經過內標校正后的金剛乙胺曲線方程因已知同位素內標物濃度而減少一定的基質效應。因此，該方法的標準工作曲線用溶劑直接配置。

2.4 線性范圍、定量限及回收率和精密度

配制含量1，2，5，10和20 ng/mL的系列標準溶液。按照其所得峰面積的平均值與對應標準溶液的質量濃度作標準曲線。同時選用不同的空白雞蛋，按照1.3小節進行添加回收試驗，分別添加質量分數1，2和10 μg/kg這3個水平的標準品，平行測定6次，以10倍信噪比對應的濃度確定方法定量限，結果見表4。說明能取得良好的回收效果。

表4 金剛乙胺的的回歸方程、相關系數及定量限

2.5 實際樣品分析

為進一步驗證試驗方法的實用性，采用該方法對市場隨機收集的40批次雞蛋樣品進行檢測，結果均未檢出。今后可通過擴大抽樣量，對該方法進行充分驗證。

3 結論

結合超高效液相色譜串聯質譜為檢測手段，建立一種測定鮮蛋中金剛乙胺的快速、簡便、準確、成本低的檢測方法。分別對提取溶劑、固相萃取柱、色譜條件做了優化研究，采用內標校正，定量限低，效果穩定，重現性好，能夠滿足精密度要求。對于實現雞蛋金剛乙胺殘留監控有著重要意義。