基于1H-NMR的飲料中苯甲酸鈉定量分析

王壽峰 ，林嘉榮，丁秀國，蘭茜，霍明官，李慧

1.四川輕化工大學化學工程學院（自貢 643000）；2.釀酒生物技術與應用四川省重點實驗室（四川輕化工大學）（宜賓 644000）；3.中昊晨光化工研究院有限公司（自貢 643201）

苯甲酸鈉由于能夠抑制酵母、霉菌及某些病菌的繁殖，被廣泛運用于飲品及口服液中，是應用時期最長、使用量最大的食品防腐劑。苯甲酸鈉過量攝入也會影響人體機體代謝平衡，引起人體過敏反應，從而導致許多慢性疾病[1]。在我國食品藥品添加劑都受到嚴格把控，《中國藥典》2020版第四部中口服液體制劑的合劑中使用苯甲酸鈉時，用量（以苯甲酸計）不得超過0.3%（其鈉鹽的用量分別按酸計）[2]，GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規定苯甲酸鈉在碳酸飲料和特殊用途飲料中的最大使用量為0.2 g/kg，在風味飲料等中的最大使用量1.0 g/kg。在歐洲，苯甲酸鹽由歐盟立法管制，軟飲料中苯甲酸鹽含量上限為0.15 g/kg，美國為0.10 g/kg[3-4]。隨著生活水平及飲食安全意識的提高，如何簡便快速測定飲品中的苯甲酸鈉含量具有現實意義。

苯甲酸鈉最常用的檢查方法是高效液相色譜檢測法[5-6]，此外熒光光譜標準加入法[7]、紫外分光光度計法等都顯示各自的優點和局限[8]。GB 5009.28—2016《食品安全國家標準食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》介紹的液相方法過程較為繁瑣，需要工作曲線，比較耗時。近年來，核磁定量法（qNMR）日益成為一種重要的分析方法[9]，在食品[10-14]、中藥材[15-18]和生物樣品分析中應用廣泛[19-20]，儀器再現性和可靠性是核磁相對于其他分析技術的主要優勢[21-27]。當前飲料市場前景廣闊，產品復雜多樣，試驗建立一種快速簡單、準確性高、專屬性強的核磁定量方法，為飲品及口服液中苯甲酸鈉的定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪碧纖維+清爽檸檬味飲料、怡泉+C檸檬味汽水、可口可樂無糖飲料、美年達飲料、飛馬能量維生素運動飲料、東鵬特飲飲料、魔爪能量飲料、康師傅冰紅茶、統一冰綠茶、玉川果園蜂蜜黃桃風味飲料、葡萄果味（臺椰）飲料、希美樂蜂蜜蘆薈風味飲料、王老吉植物涼茶飲料、加多寶涼茶飲料、歡樂家粒粒橙果粒果味飲品、統一蜜桃多水果飲料，市售；金銀花露（哈爾潼）、金銀花露（小葵花露）、金銀花露（皇城）3種OTC口服液，購自當地連鎖藥店。

苯甲酸鈉（純度99.0%）、重水（D2O，純度99.9%）、吡嗪（純度99.0%）、甲酸（分析純）、氨水（分析純）、乙腈（色譜純），上海泰坦科技有限公司；純水，由Milli-QAcademic凈化系統制得。

1.2 儀器與設備

Bruker Avance III HD 600 MHz核磁共振波譜儀，配備5 mm BBO探頭（德國Bruker公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀，配備Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；ME204百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CP214千分之一電子天平（美國奧豪斯有限公司）；Vortex 3000型渦旋振蕩器（德國Wiggens公司）；比重計（分度0.0005，衡水創紀儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的制備

標準溶液：精密稱取307.51 mg苯甲酸鈉標準品，置于100 mL容量瓶中，加入去離子水，超聲溶解，定容，分別稀釋成0.015，0.030，0.060，0.120，0.250，0.500，1.000和2.000 g/L的系列標準溶液。

內標溶液：精密稱取3.224 mg吡嗪固體于10 mL量瓶中，加入D2O稀釋溶解，定容，渦旋振蕩，得內標溶液。

供試品溶液：準確吸取540 μL樣品至核磁管中，碳酸飲料取樣前需超聲30 min脫氣，加入60 μL含內標重水溶液，渦旋30 s混合均勻，待測。

液體樣品密度測試：參照GB 5009.2—2016《食品相對密度的測定》中第三法 比重計法。

1.3.2 核磁分析與數據處理

采用Bruker標準脈沖序列noesygpprld用于水峰（δ=4.7）信號抑制，譜寬（SW）16.022，采樣點數（TD）64 K，采樣時間（AQ）3.41 s，接收增益（RG）32，掃描次數（NS）32，弛豫延遲（D1）27 s，檢測溫度298 K，樣品檢測前需等待5 min以穩定溫度。

核磁共振譜圖采用TopSpin4.1.3軟件進行相位矯正，零點矯正（吡嗪峰δ=8.66），多點基線自動矯正；對位移δ=7.49～8.66間苯甲酸鈉信號峰和位移δ=8.66吡嗪內標信號峰從根部平滑處手動積分，每個樣品重復測試5次取平均值。

1.3.3 定量公式

苯甲酸鈉質量按式（1）計算。

式中：Ws為苯甲酸鈉質量，mg；Wr為內標物質量，mg；As為苯甲酸鈉的特征峰的平均峰面積；Ar為內標峰的平均峰面積；Es為苯甲酸鈉的質子當量；Er為內標物的質子當量；質子當量重量以分子量除以特征峰的質子數計算得到。

1.4 HPLC測試方法

參考《中國藥典》2020版第四部中苯甲酸鈉HPLC法進行驗證分析。色譜柱Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。經由0.015，0.030，0.060，0.120，0.250，0.500，1.000和2.000 g/L的系列標準溶液驗證，苯甲酸鈉在0.015～2.000 g/L時與峰面積線性關系良好，線性方程為Y=75217X+88.739，相關系數r=0.9997，加標回收率為98.72%～99.21%。

2 結果與分析

2.1 弛豫時間

弛豫是指自旋平衡態的建立和重建的過程，從激發態回到平衡態所需時間為縱向弛豫時間（T1），它影響信號之間的相對積分。核磁定量應滿足弛豫等待時間（D1）大于5倍的T1，此時弛豫率為99.3%。通過布魯克核磁標準試驗反轉恢復法對苯甲酸鈉和吡嗪弛豫時間進行測試，結果見表1，最大值為5.91 s，根據D1≥5T1-AQ（采樣時間），故選定的弛豫延遲時間D1為27 s[28]。

表1 T1測試值

2.2 掃描次數

NMR靈敏度受硬件配置條件的限制，通常選擇增加掃描次數來達到一定信噪比（The signal to noise ratio，S/N），信噪比隨著掃描次數的平方根的增加而增加，但過多的掃描次數帶來測試時間的延長，一般要求核磁定量峰的信噪比不小于150。取1 g/L的苯甲酸樣品，采集核磁譜圖，數據處理，結果如圖1所示。掃描次數大于32后定量峰δ=7.88處積分值基本保持不變（設定內標吡嗪δ=8.66處積分值為1），此時的信噪比為1121.5，滿足S/N≥150的定量條件，確定試驗掃描次數為32次。

圖1 不同掃描次數分別與積分值和信噪比譜圖對比

2.3 基于1H-NMR譜的線性關系、檢出限和定量限

將1.3.1的標準溶液采用純化水進行梯度稀釋，配制成0.015～2 g/L系列標準曲線溶液，以苯甲酸鈉的物質的量濃度為橫坐標（X，g/L），縱坐標（Y）為定量峰的積分值（內標積分為1），分別以δ=7.88的積分值和δ=7.49，δ=7.56，δ=7.88積分值總和進行線性回歸擬合曲線，結果呈良好線性，結果如圖2所示。得到回歸方程Y=4.2633X+0.0035和Y=10.549X-0.0027，相關系數均為r=0.9999。1H-NMR方法的檢出限（SLOD）和定量限（SLOQ）可以確定定量試驗的精確度[29]，同時提供與其他分析方法的比較信息。基于果汁及口服液密度與水相差不大，結果表明定量限遠小于國標最低限量0.2 g/kg，也小于歐盟、美國標準的最低使用量0.1 g/kg。由分析結果看，選取苯甲酸鈉δ=7.88處單峰用于定量積分和選取全部核磁峰積分相差不大，都較準確。為了簡便，最終選取δ=7.88處單峰為定量峰，該峰與其他峰區分良好，干擾少，便于準確積分。

圖2 不同濃度苯甲酸鈉標準品的1H-NMR譜圖

2.4 精密度

按照擬定的1.1.3方法，取雪碧纖維+清爽檸檬味飲料（A）樣品，平行測定6次，將積分值導入式（1）中計算苯甲酸鈉的質量，然后通過飲料的比重ρ=0.9869（20 ℃）換算成濃度，以g/kg表示，結果見表2，SRSD為0.77%，表明測定結果精密度良好。

表2 A飲料中苯甲酸鈉樣品的1H-NMR定量結果（n=6）

2.5 方法的加標回收率

取3份雪碧纖維+清爽檸檬味飲料（A）樣品，按擬定方法制備樣品溶液，取1.0 g/L的標準溶液，向3支核磁樣品管中分別加入100，300和500 μL（含苯甲酸鈉0.1，0.3和0.5 mg），混勻，檢測。結果見表3，測得加標回收率介于98.06%～99.93%，SRSD為1.10%～1.91%。

表3 A飲料中苯甲酸鈉回收率及SRSD（n=3）

2.6 市售樣品測定

對采購19種不同類別供試品進行1H-NMR測樣，核磁譜圖如圖3所示。為簡化操作步驟樣品未調pH，樣品酸堿度的不同導致定量峰在δ=7.8～8.0略有漂移，δ=7.4～7.6的峰可作為苯甲酸鈉的參照峰，定量峰周邊無干擾。采用國標方法測試樣品的密度，將核磁定量結果和液相色譜定量結果最終換算成g/kg。根據藥典的HPLC方法檢測并與1H-NMR方法檢測結果比較，結果如表4所示。試驗樣品中，檢測的16種市售飲品均符合GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》，茶飲料和植物飲料中均未檢出苯甲酸鈉。3種口服液金銀花露樣品符合《中國藥典》2020版四部中口服液體制劑含量標準，苯甲酸鈉含量小于3 g/kg，其中金銀花露（皇城）中未檢出。2個方法定量結果的相對偏差小于5%，說明核磁定量的可行性和準確性。

圖3 不同類別飲料中苯甲酸鈉的1H-NMR譜圖對比

表4 苯甲酸鈉供試樣品的1H-NMR和HPLC結果

3 結論與討論

隨著食品行業的不斷發展，飲料產品及種類也越來越豐富，尤其是防腐劑在各種食品、產品中的安全使用范圍極為關注，針對市售軟飲料中苯甲酸鈉的含量檢測，采用1H-NMR作為檢測手段，建立飲料中苯甲酸鈉含量的定量分析方法。結果表明，在0.015～2 g/L范圍內線性良好，精密度、重復性及加標回收率均滿足含量測定要求。使用HPLC法對1H-NMR測試結果進行驗證，結果非常接近，相對偏差小于5%，證明該定量方法的可信度和可行性。核磁定量方法優勢在于重現性好，不需要標準品及工作曲線，耗時短。檢測的16種市售飲品均符合國標，茶飲料和植物飲料樣本中苯甲酸鈉未檢出。3種口服液金銀花露樣品中苯甲酸鈉含量符合《中國藥典》2020版要求，個別樣品中未檢出。試驗建立的方法簡單快捷、無損耗、靈敏度高，可為企業及市場監管部門提供重要參考，有較廣泛的應用前景。