糟辣發酵過程中細菌菌群結構分析

何彩梅，郭繼毅，李楚鴻，龔福明

1.賀州學院食品與生物工程學院（賀州 542899）；2.德宏職業學院基礎醫學院（芒市 678400）

糟辣是一款以鮮辣椒為原料，輔以姜、蒜等香辛料，加入適量鹽、白酒等輔料后經密閉發酵而制成的特色傳統發酵辣椒制品[1-2]。因其香辣、酸脆且風味獨特而深受民眾的喜愛。加之糟辣與賓宴特色菜全能百搭的菜系靈魂特性，讓糟辣成為日常生活中不可或缺的特色發酵辣椒制品。然而研究起步晚，研究方法與技術簡單，傳統小作坊式自然發酵制作導致發酵工藝不規范，作用菌群不穩定、發酵產品易軟化“生花”等因素制約了糟辣的進一步發展壯大。為此，了解糟辣中主要發酵微生物的群落結構，掌握其發酵菌群變化規律，就成為改良工藝、有效提升糟辣的安全性、擴大影響力、增加產品附加值、實現規模化工業化生產的前提條件。發酵食品中主要發酵微生物的研究始于20世紀后期，常用依賴于微生物培養的傳統方法及免培養的分子生物學方法。隨著技術進步，基于高通量測序技術分析復雜樣品體系微生物多樣性的方法體系成為當前最佳的方法，并被廣泛用于菠蘿奶酪，韓國“doenjang-meju”，四川泡菜等傳統發酵食品中微生物多樣性的分析[3-6]。試驗采用高通量三代測序分析技術，對糟辣發酵過程中細菌菌群結構的變化進行分析，掌握其發酵規律，以期為糟辣的工藝改良及益生性菌株資源的開發提供依據及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青美人椒、糯米粥水、桂林三花酒、鹽、壇子。

1.2 方法

1.2.1 糟辣的發酵制作工藝

按傳統發酵工藝制作，青美人椒清洗，控干水分，入壇，加糯米粥水（需浸沒壇中的青美人椒）、鹽和酒，封壇，自然條件下發酵。

1.2.2 取樣

每次取樣前需對糟辣發酵液進行充分混勻，并于4，7，10，15，20，25，35，45，55，65和90 d取樣（發酵液），編號為ZLD4～ZLD90，每次取3個平行樣。

1.2.3 微生物群落結構檢測

提取樣品DNA，PCR擴增DNA產物。DNA擴增產物送上海擎科生物公司進行高通量測序，對測序結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 糟辣樣品發酵過程中的α多樣性指數分析

根據97.0%相似度水平下進行聚類，獲得OTU信息，采用α多樣性指標的ACE指數、Chao1指數、Simpson指數、Shannon指數對樣品微生物物種豐度和多樣性進行評估。圖1為糟辣不同發酵時間樣品的細菌稀釋曲線。由圖1可知，各發酵糟辣樣品的稀釋曲線隨著測序數量的增加呈先上升后趨向平坦趨勢，說明樣品進行測序過程中所選的測序數據量已足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物菌群信息，繼續增加測序數量也無法找到更多的物種，表明測序數據合理，可以進行數據分析。Chao1和ACE指數值越大說明微生物群落的豐度越高；Simpson指數值較大，說明群落多樣性較低；Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高。由表1可知，糟辣發酵10 d樣品的Chao1和Shannon指數比其他發酵天數的樣品高，表明糟辣發酵10 d的物種多樣性最高，物種最豐富。糟辣發酵90 d樣品的Chao1和Shannon指數比其他發酵天數樣品低，表明糟辣發酵90 d樣品的物種豐富度及多樣性最低。從糟辣發酵0～90 d過程看，物種豐富度及多樣性都呈先增加后減小趨勢。

表1 樣品α多樣性指數

圖1 樣品稀釋曲線

2.2 糟辣樣品發酵過程中的細菌物種組成

根據聚類得到的OTUs分析結果，將糟辣不同發酵時間各樣品組OUT結果繪制成花瓣圖，結果如圖2所示。經過16S rRNA擴增子測序，在糟辣中共得到339個OTU，其中不同發酵時間糟辣樣品組分別含有21，20，162，20，19，19，15，19，20，9和15個OUT。所有糟辣發酵樣品共同的物種有2個，為乳桿菌屬（Lactobacillus）和雷爾菌屬（Ralstonia）。ZLD10樣品特有物種最多，為118個，ZLD45樣品特有物種僅1個，表明糟辣發酵10 d，細菌物種最多，此時糟辣發酵最活躍。

圖2 特征花瓣圖

由表2和圖3可知，從門分類水平上，11個糟辣發酵樣品共檢測到厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍細菌（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和梭桿菌門（Fusobacteria）等18個細菌門類及其他未分類的門。其中優勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）。發酵4 d及7 d的樣品中厚壁菌門（Firmicutes）占比分別為88.7%和93.7%。發酵10 d厚壁菌門（Firmicutes）大幅減少，為18.9%，變形菌門（Proteobacteria）大幅增加，占比72.1%。發酵15 d及之后的不同發酵時間樣品中厚壁菌門（Firmicutes）起主導作用，占比在98.3%～99.7%。從屬分類水平上，11個樣品共檢測到126個細菌屬，除ZLD10樣品優勢屬為氣單胞菌屬（Aeromonas）（30.2%），其他樣品的優勢屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），且占比較大，占比74.6%～99.7%，表明糟辣發酵過程中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）大量存在，其在糟辣發酵過程中發揮重要作用。ZLD10樣品細菌屬最多，為119個，主要有氣單胞菌（Aeromonas）（30.2%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（12.4%）、埃希菌屬（Escherichia）（11.8%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（7.9%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（5.3%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（2.9%）、雷爾菌屬（Ralstonia）（2.7%）和乳球菌屬（Lactococcus）（1.1%）等。氣單胞菌屬（Aeromonas）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、魏斯菌屬（Weissella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等只在發酵前期大量存在，發酵后期占比降低，直至降至零。從種分類水平上，ZLD10樣品分類單元最多，為145個，主要為嗜水氣單胞菌（Aeromonas_hydrophila）（30.2%）、大腸桿菌（Escherichia_coli）（11.8%）、魯氏不動桿菌（Acinetobacter_lwoffii）（6.6%）、不動桿菌（Acinetobacter_sp.）（5.2%）、假腸明串珠菌（Leuconostoc_pseudomesenteroides）（2.9%）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus_pentosus）（3.5%）等，其中嗜水氣單胞菌（Aeromonas_h y drophila）、大腸桿菌（Escherichia_coli）、魯氏不動桿菌（Acinetobacter_lwoffii）、不動桿菌（Acinetobacter_sp.）等為致病菌，其他樣品的優勢種為戊糖乳桿菌（Lactobacillus_pentosus）（74.5%～98.3%）。發酵35，45和55 d的樣品中含有一定比例的消化乳桿菌（Lactobacillus_alimentarius），分別為7.9%，8.7%和7.2%，隨后減少。戊糖乳桿菌（Lactobacillus_pentosus）和消化乳桿菌（Lactobacillus_alimentarius）為益生菌，與糟辣發酵產乳酸、乙酸呈正相關的菌[7]，在發酵食品中起重要作用。

表2 樣品物種統計表

圖3 細菌門（a）、屬（b）和種（c）水平的群落分布圖

2.3 糟辣發酵過程物種差異分析

糟辣不同發酵時間的細菌主成分分析如圖4所示。2個樣品距離越近，則表示2個樣品的菌群組成越相似。由圖4可知，細菌PC1和PC2對樣品的貢獻分別為95.87%和3.03%，共計98.9%，可以代表絕大部分變量信息。ZLD10與其他樣品點之間的距離較遠，說明ZLD10樣品與其他樣品的菌群組成差異較大。發酵20和25 d及發酵65和90 d糟辣樣品組之間的細菌群落組成差異較小，且發酵前期與發酵后期樣品的菌群組成有差異。ZLD10樣品對PC1軸的貢獻最大，ZLD4樣品對PC2軸的貢獻最大。

圖4 PCA分析圖

3 結論

利用高通量三代測序技術揭示糟辣發酵過程中細菌菌群的組成及變化規律。糟辣發酵過程中優勢門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；優勢屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和氣單胞菌（Aeromonas）；優勢種為戊糖乳桿菌（Lactobacillus_pentosus）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas_hydrophila）。糟辣發酵前期樣品的物種豐富度及多樣性與發酵后期不同，特別是發酵第10天，物種豐富度及多樣性最高，含致病菌較多，從食用安全考慮，發酵樣品10 d后再食用。乳酸桿菌屬是發酵過程中處于絕對優勢微生物，最高相對豐度達99.7%，在糟辣發酵中起著重要作用。試驗探究糟辣發酵過程中細菌菌群的變化，為精確人工調控提供理論依據。