洋蔥槲皮素對免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響

倪灣，高碩

錦州醫(yī)科大學醫(yī)療學院（錦州 121013）

洋蔥為百合科蔥植物，原產(chǎn)地亞洲西部，在我國分布范圍十分廣闊，栽培歷史悠久，四季皆有。因其內(nèi)部細嫩，生吃味道微辣較甜，熟吃軟嫩可口，味質(zhì)極佳，被譽為“菜中皇后”“心臟支架”。洋蔥資源豐富，營養(yǎng)價值較高，富含槲皮素和前列腺素A等營養(yǎng)物質(zhì)，使洋蔥具有很多其他食物不可取代的健康功效，在降血脂[1]、抗動脈硬化作用[2]、預防惡性腫瘤[3]及降血糖[4]等方面均具有較強藥理作用。同時，洋蔥也是藥食兩用上等補品，具有殺菌抗寒，預防感冒的功效，辛辣的氣味還可以促進腸胃消化腺分泌，增進食欲，甚至可以有效控制“三高”，因此洋蔥常作為功能性食品原料用于生產(chǎn)抗氧化及預防心腦血管疾病保健食品[5]。由于其具有獨特的營養(yǎng)價值，近年來國內(nèi)外市場對洋蔥的需要量逐漸增多，并將以其藥食同源的獨特風格進入國際市場。

洋蔥槲皮素（OQE），是從洋蔥表皮部位提取分離純化得到的一種天然黃酮類化合物，有研究表明洋蔥富含的類黃酮物質(zhì)可使血小板的黏稠度下降，經(jīng)常食用洋蔥可以預防血栓類疾病，同時可以減少降低心梗和腦血栓的發(fā)生率[6]。根據(jù)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥槲皮素具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、預防骨質(zhì)疏松[9]、保護心腦血管[10]、抗肥胖作用[11]等功效。

隨著生活水平的提高及科技的進步，對洋蔥槲皮素在降血脂、抗腫瘤及抗氧化功能方面的研究報道越來越多，但其免疫調(diào)節(jié)活性尚未得到廣泛研究。OQE毒性小，不良反應少，所以有望開發(fā)成作為藥食同源的保健食品原材料，因此其需求量將越來越多。免疫力是指機體抵抗外來侵襲，維護體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的能力，免疫系統(tǒng)是人體健康的基石[12]。新冠病毒的暴發(fā)打破人們的傳統(tǒng)生活方式，“陽康”之后的人群普遍免疫力降低，因此增強機體免疫力十分關鍵，增強免疫力的保健食品也受到關注和歡迎。為在臨床及開發(fā)新的功能食品方面的廣泛應用，對洋蔥抗氧化、抗炎、增強免疫力等方面的研究仍是研究重點，因此，為更深入探討其免疫活性，對OQE的更進一步開發(fā)和加強其保健功能及藥用價值的利用具有重要意義。

為探討OQE的免疫調(diào)節(jié)活性，試驗以環(huán)磷酰胺（CY）免疫損傷小鼠為模型，探討OQE對小鼠免疫及抗氧化能力的影響。試驗采用MTT法觀察OQE體內(nèi)對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，采用ELISA法觀察OQE對免疫抑制小鼠淋巴細胞中IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ分泌的影響，采用q-PCR檢測OQE對免疫抑制小鼠淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γmRNA表達水平的影響，旨在明確OQE提高機體免疫力的作用，為OQE的進一步開發(fā)功能食品和臨床應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Balb/c小鼠[SPF級，體重20±2 g，6～8周齡，錦州醫(yī)科大學生命科學院，生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2014-0004]；OQE（純度≥98%，MUST-12062610，西安天瑞生物技術(shù)有限公司）；新生牛血清、甲基噻唑藍（MTT）、臺盼藍、RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）和磷酸鹽緩沖溶液（PBS），碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ細胞因子檢測試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物和試驗設計

將50只小鼠分成5組，每組10只。正常組（NC）和環(huán)磷酰胺組（CY）灌胃生理鹽水，灌胃14 d。洋蔥槲皮素低劑量組（CY+OQL）、中劑量組（CY+OQM）、高劑量組（CY+OQH）分別給予50，100和200 mg/kg的洋蔥槲皮素，灌胃14 d。CY、CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH分別于第1～第3天腹腔注射CY（100 mg/kg），NC按相同方法注射生理鹽水。最后一次灌胃后24 h處死小鼠。所有動物試驗均按照錦州醫(yī)科大學醫(yī)療學院倫理委員會和實驗動物中心的規(guī)程進行，并按照當?shù)貍惱碇改线M行。

1.2.2 淋巴細胞懸液制備

參考王平等[13]試驗方法，小鼠用頸椎脫臼法處死，用75%酒精浸泡3 min消毒，將取出的各組脾臟分離放入超凈無菌工作臺，放入PBS中搗碎，用0.0750 mm（200目）的細胞篩進行過濾，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，制成淋巴細胞懸液，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測免疫抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖

按1.2.1試驗分組及處理各濃度組后檢測免疫抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖情況，將淋巴細胞接種于96孔板中（5×106細胞/mL），每組均設5復孔，每孔加入100 μL淋巴細胞懸液。在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT（5 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，用酶標儀測量波長為570 nm的吸光度。結(jié)果以增殖指數(shù)（PI）反映小鼠脾淋巴細胞增殖率，按式（1）計算。

1.2.4 ELISA法檢測細胞因子的分泌

按1.2.1試驗分組及處理各濃度組后檢測免疫抑制小鼠脾淋巴細胞因子的分泌情況，將1 mL淋巴細胞接種于12孔板中（5×106細胞/mL），每組均設5復孔，在37 ℃ 5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h后，按1500 r/min 4 ℃離心5 min，收集上清液。根據(jù)試劑盒說明書檢測脾淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的分泌，用酶標儀進行測量。

1.2.5 q-PCR法檢測mRNA表達量

小鼠將脾細胞在37 ℃ 5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h。使用Trizol法從培養(yǎng)后的脾淋巴細胞提取RNA，并根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA合成，合成條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。采用Eppendorf AG 22331機器（Hamburg，Germany）和Takara反轉(zhuǎn)錄PCR說明書進行實時熒光定量PCR，定制引物見表1。實時熒光PCR反應條件為95 ℃ 30 s，在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s下進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析以得到目的基因的表達量。

表1 PCR引物設計

1.2.6 統(tǒng)計學分析

各組數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。應用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，數(shù)值以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，以Tukey法進行顯著性檢驗，檢驗水準P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥槲皮素對免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖的影響

由圖1可知：與空白組相比，環(huán)磷酰胺組淋巴細胞指數(shù)顯著降低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明免疫低下模型構(gòu)建成功；CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH組淋巴細胞指數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢（P＜0.05），說明OQE能夠刺激淋巴細胞增殖；OQE濃度50～200 mg/kg濃度范圍時，淋巴細胞增殖指數(shù)隨OQE濃度升高出現(xiàn)顯著上升趨勢，表現(xiàn)出一種劑量依賴關系，并且組間差異顯著（P＜0.05）。由此可以說明，OQE對小鼠淋巴細胞增殖呈現(xiàn)正向調(diào)節(jié)作用，并且各組間均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 洋蔥槲皮素對淋巴細胞增殖的影響（x±s，n=5）

2.2 洋蔥槲皮素對免疫抑制小鼠淋巴細胞因子分泌的影響

由圖2～圖5可知：與空白組相比，IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的CY組分泌量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與空白組相比，CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH組中細胞因子分泌量呈現(xiàn)升高趨勢，說明OQE能夠誘導細胞因子分泌；洋蔥槲皮素濃度50～200 mg/kg范圍時，CY+OQH組小鼠IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的分泌量均高于CY+OQL組，隨著OQE濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢；結(jié)果表明200 mg/kg OQE對改善免疫低下小鼠免疫活性分子水平效果較好。由此提示OQE處理對免疫低下小鼠的免疫功能具有提高作用。

圖2 OQE對淋巴細胞IL-2分泌的影響

圖3 OQE對淋巴細胞IL-6分泌的影響

圖4 OQE對淋巴細胞IL-12分泌的影響

圖5 OQE對淋巴細胞IFN-γ分泌的影響

2.3 洋蔥槲皮素對淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ mRNA的影響

由圖6～圖9可知：與空白組相比，IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γCY組的mRNA表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與空白組相比，CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH組中細胞因子mRNA表達量呈現(xiàn)升高趨勢，說明OQE能夠誘導mRNA的表達；OQE濃度在50～200 mg/kg范圍時，CY+OQH組小鼠IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的mRNA表達量均高于CY+OQL組，隨著OQE濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢；由此結(jié)果顯示洋蔥槲皮素可使免疫低下小鼠部分免疫細胞核轉(zhuǎn)錄因子的表達水平得以改善，與2.2所得結(jié)果相一致。

圖6 OQE對淋巴細胞IL-2 mRNA的影響

圖7 OQE對淋巴細胞IL-6 mRNA的影響

圖8 OQE對淋巴細胞IL-12 mRNA的影響

圖9 OQE對淋巴細胞IFN-γ mRNA的影響

3 討論

3.1 洋蔥槲皮素對免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖的影響

免疫低下通常表現(xiàn)體內(nèi)免疫功能異常，并且可以導致機體容易感染或發(fā)生免疫性疾病。試驗表明：洋蔥槲皮素濃度在50～200 mg/kg范圍內(nèi)，其對小鼠淋巴細胞體內(nèi)增殖具有促進作用；OQE濃度200 mg/kg時效果最佳，與CY組差異顯著，有效提高小鼠淋巴細胞增殖的能力。脾臟作為機體最大的外周免疫器官，是淋巴細胞居留增殖的場所，淋巴細胞作為機體免疫系統(tǒng)的主要細胞群體，產(chǎn)生特異性免疫應答，因此脾臟的免疫功能的正常發(fā)揮與其生長發(fā)育和組織結(jié)構(gòu)有著密切關系[14]。因此，可以說脾臟生長發(fā)育的情況和脾臟里淋巴細胞的增殖和凋亡緊密相關。試驗中，OQE可使免疫抑制小鼠的淋巴細胞顯著提升，在免疫應答過程中淋巴細胞增殖產(chǎn)生效應淋巴細胞，這些免疫活性細胞接受抗原刺激后，共同完成對抗原物質(zhì)的識別、應答、清除，進行特異性免疫應答，互相協(xié)調(diào)制約，從而達到機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。淋巴細胞增殖情況反映機體免疫應答反應的強度，體現(xiàn)機體的細胞免疫狀態(tài)。但對OQE免疫活性的調(diào)節(jié)作用尚不明確，還有待進行更深入研究。

3.2 洋蔥槲皮素對免疫抑制小鼠淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ分泌及mRNA的影響

淋巴細胞在機體免疫應答過程中發(fā)揮重要作用，淋巴細胞的增殖效果可作為評估動物的免疫反應能力的最有力的指標[15]。細胞因子在維持體內(nèi)平衡及先天和適應性免疫反應當中發(fā)揮重要作用，而失調(diào)的細胞因子則會對人體產(chǎn)生一些影響，如導致慢性炎癥、過敏反應、肥胖、糖尿病、高血壓等疾病[16]。因此，需調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生，使得體內(nèi)特定的細胞群體間互相協(xié)調(diào)，維持正常生理平衡。試驗判斷OQE對免疫抑制小鼠淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ均有不同程度的誘導分泌作用，調(diào)節(jié)失調(diào)的細胞因子，維持平衡。

細胞因子之間往往是一個十分復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，它們之間的相互作用可以調(diào)節(jié)機體生理平衡，從而達到相應的細胞應答水平。IL-2具有促進T淋巴細胞分化和增殖的作用，促進B淋巴細胞的生長和發(fā)育，增強B淋巴細胞的增殖及抗體分泌[17]。IFN-γ是一種由Th1和NK細胞響應IL-12產(chǎn)生的細胞因子，可促進Th1免疫反應的進行和巨噬細胞的活化，在許多細胞系統(tǒng)中具有與Th2型細胞因子拮抗的生物學功能[18]。IFN-γ具有抗病毒[19]、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性[20]。在免疫反應中，IL-12主要作用于淋巴細胞，是Th1細胞免疫應答的決定因素。IL-6是由多種由免疫細胞和非免疫細胞產(chǎn)生，具有多效性，且IL-6在多種細胞類型的分化中發(fā)揮重要作用，可以增強免疫反應[21]。免疫系統(tǒng)之間的紐帶發(fā)揮核心作用因此，試驗觀察OQE對IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ細胞因子的分泌和mRNA表達的影響判斷免疫活性。綜上可見，試驗中不同濃度OQE處理可在不同程度上促進淋巴細胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ的分泌和上調(diào)mRNA表達，進一步調(diào)節(jié)免疫活性。

4 結(jié)論

OQE在體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫抑制小鼠淋巴細胞免疫活性中起著重要作用，洋蔥槲皮素在50～200 mg/kg濃度范圍內(nèi)，免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖顯著增加，通過促進IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ細胞因子的分泌，上調(diào)mRNA表達量實現(xiàn)免疫活性的提高，從而提高機體免疫功能，維持生理平衡和人類的健康，為利用OQE開發(fā)增強免疫功能的產(chǎn)品提供研究基礎。