澳洲堅果蛋白的酶法增溶工藝

繆福俊，劉潤民，李文玕，廖永堅，郭剛軍，寧德魯

1.云南省林業和草原科學院（昆明 650201）；2.云南省熱帶作物科學研究所（景洪 666100）

澳洲堅果是世界著名堅果，也是我國重要的木本油料之一，種植面積已躍居世界第一位，在我國主要種植區域為云南、廣西、廣東、貴州[1-2]。澳洲堅果富含油脂、蛋白等營養成分，具有多種生物活性[3-4]。澳洲堅果餅粕（Macadamia nut cake，MNC）是澳洲堅果油工業的副產品，與其他油籽餅一樣，MNC也是蛋白質的優質來源，蛋白質含量達30%，氨基酸比值系數分達86.95[5-6]。澳洲堅果蛋白主要由谷蛋白（63.18）、醇溶蛋白（14.95%）、球蛋白（14.58%）、清蛋白（7.29%）組成[7]。

然而，谷蛋白具有水不溶性的特點，導致其乳化性、起泡性等功能特性較差，嚴重限制其在飲料、營養蛋白等食品中的應用[8-9]。因此，必須對澳洲堅果蛋白進行增溶改性，才能將其廣泛應用于食品中。生物改性中的酶解改性具有安全、快速、條件溫和、易操作等優點，通過酶法改性能夠改善植物蛋白的溶解性、起泡性、乳化穩定性等功能性質[10-11]。張氽等[12]研究大米蛋白在中性條件下的酶解增溶工藝，大米蛋白中游離氨基酸和肽含量顯著增加，溶解性明顯改善。澳洲堅果蛋白酶解增溶方面的研究還鮮有報道。因此，針對澳洲堅果蛋白富含谷蛋白導致溶解性差，傳統堿溶酸沉工藝制備的蛋白粉存在含鹽量高、口感差、色澤深等問題，試驗采用綠色生物酶法結合純物理提取技術從MNC中提取水溶性蛋白，確定適用于澳洲堅果速溶蛋白粉（Macadamia nut instant protein powder，MIP）增溶改性生產工藝，制備高溶解性MIP，以期為澳洲堅果蛋白的精深加工提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

澳洲堅果仁（云南省熱帶作物研究所）；中性蛋白酶（酶活力10萬 U/g，龐博生物公司）。

全自動液壓榨油機（6YY-280型，山東沂水陽東機械有限公司）；蛋白粉生產線（40 kg/d，云南省木本油料工程技術研究中心）；氨基酸自動分析儀（A300型，德國MembraPure GmbH公司）；全自動凱氏定氮儀（UDK-159型，意大利VELP公司）；高效液相色譜儀（2695型，美國沃特世公司）。

1.2 方法

1.2.1 澳洲堅果粕粉制備

采用全自動液壓榨油機在室溫條件下對澳洲堅果碎仁進行壓榨制油，獲得餅粕（蛋白含量26.40%）。采用粉碎機對餅粕進行粉碎，經膠體磨按料液比1∶1（g/mL）進行磨漿，獲得澳洲堅果粕粉漿液。

1.2.2 酶法提取MIP流程

澳洲堅果仁→壓榨→粕粉→磨漿→酶解→離心分離→蛋白液→噴霧干燥→蛋白粉

1.2.3 酶解條件的單因素試驗

1.2.3.1 料液比

固定酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h、加酶量1.5%，在5個梯度的料液比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5 g/mL）條件下進行提取，測定水解度和溶解度，確定最佳料液比。

1.2.3.2 酶解溫度

固定料液比1∶3（g/mL）、酶解時間2 h、加酶量1.5%，在5個梯度的酶解溫度（40，45，50，55和60℃）條件下進行提取，測定水解度和溶解度，確定最佳酶解溫度。

1.2.3.3 酶解時間

固定料液比1∶3（g/mL）、酶解溫度50 ℃、加酶量1.5%，在5個梯度的酶解時間（1，2，3，4和5 h）條件下進行提取，測定水解度和溶解度，確定最佳酶解時間。

1.2.3.4 酶用量

固定料液比1∶3（g/mL）、酶解時間2 h、酶解溫度50 ℃，在5個梯度的酶用量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）條件下進行提取，測定水解度和溶解度，確定最佳酶用量。

1.2.4 酶解條件的正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取L9(34)正交試驗，考察料液比、酶解溫度、酶解時間、酶用量4個因素對MIP溶解度的綜合影響，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.5 溶解度和水解度測定

1.2.5.1 溶解度

采用凱氏定氮儀檢測酶解液中蛋白含量[12]。溶解度按式（1）計算。

1.2.5.2 水解度

采用茚三酮比色法測定[13]。水解度按式（2）計算。

1.2.6 MIP蛋白含量和氨基酸組成檢測

依據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》，采用全自動凱氏定氮儀測定MIP樣品中蛋白質量分數；依據GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸自動分析儀測定MIP樣品中17種氨基酸組成及質量分數。

1.2.7 MIP多肽分子量檢測

采用高效液相色譜測定MIP樣品分子質量。色譜條件：色譜柱TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：乙腈-水-三氟乙酸40∶60∶0.1（體積比）；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。

1.2.8 數據處理

采用Excel和SPSS軟件進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 MIP提取工藝單因素試驗結果

2.1.1 料液比對MIP水解度和溶解度的影響

蛋白質水解度影響蛋白質提取率，溶解度影響蛋白質水溶性，以水解度和溶解度為指標，研究MIP增溶改性的最佳工藝條件。研究料液比對MIP水解度和溶解度的影響，結果如圖1所示。隨著料液比的降低，MIP的水解度和溶解度逐漸增加，料液比1∶3（g/mL）時，二者達到最大值，這一比值繼續降低時，出現下降趨勢。說明溶劑的增加，一方面有助于水溶性蛋白的溶出，另一方面有助于增加蛋白質與酶分子作用位點，提高水解度和溶解度。

圖1 料液比對MIP水解度和溶解度的影響

2.1.2 酶解時間對MIP水解度和溶解度的影響

進一步研究酶解時間對MIP水解度和溶解度的影響，結果如圖2所示。在1～5 h范圍內，MIP水解度和溶解度隨著酶解時間延長而增加。酶解3 h后，水解度和溶解度增長緩慢，趨于平緩。綜合增溶效果，酶解最適宜時間為3 h。

圖2 酶解時間對MIP水解度和溶解度的影響

2.1.3 酶解溫度對MIP水解度和溶解度的影響

酶解溫度是影響MIP水解度和溶解度重要因素之一。由圖3可知，在40～60 ℃范圍內，水解度和溶解度呈現典型的峰形。隨著酶解溫度的增加，水解度和溶解度升高，到50 ℃時，達到最大值。

圖3 酶解溫度對MIP水解度和溶解度的影響

2.1.4 酶用量對MIP水解度和溶解度的影響

由圖4可知，隨著酶用量的增加，MIP水解度和溶解度不斷增大。酶用量大于1.5%時，水解度和溶解度的增幅趨于平緩。考慮到生產成本，選取1.5%的酶用量。

圖4 酶用量對MIP水解度和溶解度的影響

2.2 MIP提取工藝正交試驗結果

依據單因素試驗結果，采用正交試驗進一步優化MIP提取工藝參數（表2）。MIP提取4個因素對溶解度影響的主次順序為A＞B＞C＞D，即料液比＞酶解溫度＞酶解時間＞酶用量，料液比對MIP溶解度影響最大，影響最小的為酶用量。最佳工藝條件為A2B2C2D3，即料液比1∶3（g/mL）、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h、酶用量2.0%，對此最佳工藝進行中試生產實踐。

表2 MIP制備正交試驗結果

2.3 MIP提取工藝生產實踐

2.3.1 工藝流程

MIP制備中試生產線位于云南省木本油料工程技術研究中心（云南省林業和草原科學院）。該生產線主要由膠體磨、酶解罐、臥式離心機、濃縮機、高壓均質機、噴霧系統、包裝機等組成，工藝流程如圖5所示。

圖5 MIP生產工藝

2.3.2 工藝實踐

澳洲堅果餅粕粉制備：將澳洲堅果仁通過全自動液壓榨油機進行壓榨制油，獲得脫脂餅粕，經粉碎機粉碎后制得粕粉。

磨漿：以20 kg粕粉為例，按料液比1∶1（g/mL）加入20 L軟水，輸送至膠體磨進行磨漿2～3次。

增溶改性：將漿料輸送至酶解罐中，加入40 L軟水（料液比1∶3 g/mL），開始攪拌（60 r/min）并加熱至50 ℃，加入2%中性蛋白酶（400 g）進行酶解，3 h后升溫至90 ℃進行滅酶活，降溫至50 ℃時，將酶解液泵入臥螺分離機進行離心，固相可進行二次提取，液相泵入均質罐。

均質與噴霧干燥：將酶解液進行高壓均質2次后，按一定流量泵入噴霧塔進行干燥（進風溫度170～190 ℃、排風口溫度70～85 ℃），獲得MIP。MIP蛋白含量44.75%，蛋白得率44.11%，蛋白提取率74.77%，水解度7.23%，溶解度81.56%，說明正交試驗模型擬合較好。通過工藝探索與實踐，確定適用于MIP生產工藝參數和設備組成，為后續相關產品研發提供技術支撐。

2.4 MIP氨基酸組成

MIP游離氨基酸含量如表3所示。氨基酸總量為39.58 g/100 g，游離氨基酸含量達2 g/100 g的為Glu、Arg、Asp、Leu、Tyr和Gly。其中Glu含量最高，為9.09 g/100 g。試驗表明，多肽中Glu、Arg、Asp、Gly和特異性氨基酸的含量與羥自由基的清除能力密切相關，Asp和Glu會顯著增加抗氧化活性，如果缺失Asp和Glu會減弱抗氧化活性[14-15]。此外，Asp可以參與核苷酸代謝，促進細胞周期進程，改善機體生長性能[16]。試驗中，MIP富含Glu、Arg、Asp等功能氨基酸，具有多種生物活性，有待進一步研究。

表3 MIP中游離氨基酸含量

2.5 MIP中肽段分子量范圍

采用液相色譜方法檢測MIP中肽段分子量分布，結果如圖6所示。MIP中肽段分子量范圍如表4所示。1000 Da以下的肽段占73.54%，0～500 Da范圍肽段占62.84%，小于180 Da肽段占比35%。研究表明，分子量在1000 Da以下，氨基酸鏈長度在2～20個殘基之間的小肽通常最活躍，因為與較大尺寸的肽相比，它們更容易被腸道吸收并滲透到細胞中[17]。檢測結果表明，MIP中1000 Da以下的肽段達70%以上，蛋白中的活性序列在酶解過程中得到充分釋放，有利于機體吸收。

圖6 MIP多肽分子量測試峰圖

表4 MIP中多肽段分子量范圍

3 結論

在中性條件下，通過物理磨漿和酶解工藝研究MIP的制備工藝。在料液比1∶3（g/mL）、酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h、酶用量2.0%的工藝條件下，MIP蛋白含量44.75%，蛋白得率44.11%，蛋白提取率74.77%，具有較高的水解度（7.23%）和溶解性（81.56%）。此外，經酶解增溶，MIP中游離氨基酸和小分子肽段含量增加，賦予MIP多種生物活性功能，營養價值也得到明顯改善，可應用于健康食品領域中。通過不斷探索與創新，形成MIP制備的特殊工藝，為高品質蛋白粉的生產提供技術保障。