香蔥提取液對香腸中亞硝酸鹽的影響

丁楠，何星璐，邸佳妮

錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121001）

眾所周知，腌臘肉制品是我國一種傳統且受眾廣泛的肉制品，但在腌臘肉制品中需要加入亞硝酸鹽的量也比其他種類的食品要多一些[1]。從健康角度考慮，不應長期食用亞硝酸鹽含量高的食品，否則會增加亞硝酸鹽的中毒和患癌的風險，對人體不利。在現代食品加工的研究上，研究人員想方設法減少亞硝酸鹽攝入或是找到其代替品，然而根據已查閱到的文獻及科研前沿的研究成果顯示，尚無法找到完全代替亞硝酸鹽的物質。根據已有研究成果可知，利用果蔬能起到清除亞硝酸鹽的作用[2]，但是如果將其直接應用在腌臘肉制品中，效果卻不一定能夠達到期望值，因為對于大多數果蔬而言，它們本身具有一定特殊的氣味，這些氣味如果殘留在腌臘肉制品中會對腌臘肉制品的風味產生消極影響。因此，有科研工作者將研究目光轉向農產品。特別是主要用于調味的農產品，如有大蔥[3]、洋蔥、蒜[4]、姜[5]等，但是已有文獻卻發現少有人研究香蔥是否能夠在一定程度上清除亞硝酸鹽。

香蔥也叫細香蔥，在南方地區如廣西、云南、廣東等地區常見用于調味，在北方地區少見。香蔥隸屬蔥屬（Allium）植物，在蔥屬植物中黃酮類化合物等功能活性成分含量較高，所以蔥屬植物表現出抗血小板凝集、抗氧化等功能活性[6]。且有研究報道，黃酮對食品中的亞硝酸鹽具有一定抑制或清除作用[7]。又由于香蔥含有這些物質，所以香蔥也應具有清除亞硝酸鹽的能力，且將香蔥提取液加入香腸中去除亞硝酸鹽的研究還未見報道。因此，試驗研究在不同條件下香蔥提取液對于香腸中亞硝酸鹽的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

雙匯火腿腸、細香蔥（均為市售）。

1.1.2 試驗試劑

對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、無水乙醇、硼酸鈉、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、鹽酸、亞鐵氰化鉀（均為分析純）。

1.1.3 試驗設備

AXM分析天平（上海精密科學有限公司）；HMU臺式離心機（長沙英泰儀器有限責任公司）；UV-5100紫外可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；TU-53水浴鍋（精科華瑞儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細香蔥提取液的制備

取100 g經過初步處理并研磨好的細香蔥，向其中加入200 mL蒸餾水，攪拌過濾后，靜置一段時間，吸取上清液，離心10 min，取上層清液，得到濾液，備用。

1.2.2 樣品的制備

稱取5 g經過處理呈碎末狀的火腿腸，放入燒杯中，與飽和硼砂溶液攪拌均勻，再加入300 mL 70 ℃的溫水，移入500 mL容量瓶定容，在沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫。先后加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液來沉淀蛋白，放置0.5 h后去除上層脂肪，用濾紙濾去上清液，最終制得濾液，備用[1]。

1.2.3 亞硝酸鹽清除率的測定

選擇一個50 mL容量瓶，向其中加入2 mL火腿腸樣品液、一定體積的香蔥提取液及相應的各種試劑，測吸光度并按式（1）計算清除率。

式中：Ax為不同香蔥提取液的用量或不同水浴時間或不同pH或不同水浴溫度或不同反應時間下的吸光度；A0為空白試驗組的吸光度。

1.3 單因素試驗

1.3.1 香蔥提取液用量對清除亞硝酸鹽的影響

在水浴溫度90 ℃、反應pH 12、水浴時間10 min、反應時間10 min條件下，設香蔥的提取液用量1，2，3，4和5 mL，在此條件下按照試驗方法中的步驟操作，測定亞硝酸鹽的清除率。

1.3.2 水浴溫度對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

在反應pH 12、水浴時間10 min、香蔥提取液3 mL、反應時間10 min條件下，設水浴溫度55，65，75，85和95 ℃，在此條件下按照試驗方法中步驟操作，測定亞硝酸鹽清除率。

1.3.3 反應pH對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

在水浴溫度85 ℃、香蔥提取液3 mL、水浴時間10 min、反應時間10 min條件下，設反應pH 9，10，11，12和13，在此條件下按照試驗方法中步驟來操作，測定亞硝酸鹽清除率。

1.3.4 水浴時間對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

在水浴溫度85 ℃、反應pH 12、反應時間10 min、香蔥提取液3 mL條件下，設水浴時間5，10，15，20和25 min，在此條件下按照試驗方法中操作，測定亞硝酸鹽清除率。

1.3.5 反應時間對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

在水浴溫度85 ℃、反應pH 12、香蔥提取液3 mL、水浴時間15 min條件下，設反應時間5，10，15，20和25 min，在此條件下按照試驗方法中步驟來操作，測定亞硝酸鹽清除率。

1.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上選出影響因子最大的3個因素，在此基礎上得出響應面Box-Behnken試驗設計，以香蔥提取液用量（A）、水浴溫度（B）、反應時間（C）為影響因子，亞硝酸鹽清除率（Y）作為響應值，進行三因素三水平的響應面優化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.5 數據處理

試驗數據重復3次，作圖分析及數據處理采用的軟件有Origin 2021軟件、Office和Design-Expert 13軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 香蔥提取液用量對清除亞硝酸鹽的影響

由圖1可知，在其他因素相同條件下，隨著香蔥提取液用量逐漸增加，在香蔥用量1～3 mL范圍內，亞硝酸鹽清除率呈逐漸上升趨勢，并在香蔥提取液用量3 mL時亞硝酸鹽清除率達到最大，達88.23%。但隨著香蔥提取液用量繼續增加，亞硝酸鹽清除率反而降低，可能是由于用量越大，其中摻雜的無關物質也相對增多，使得有效物質濃度相對降低，對清除亞硝酸鹽有一定的消極影響。

圖1 不同香蔥提取液用量對亞硝酸鹽清除率的影響

2.1.2 水浴溫度對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

香蔥提取液是利用水浴法制備的。由圖2可知，在55～85 ℃的溫度范圍內，由于水浴溫度的升高，香蔥提取液對亞硝酸鹽的清除能力逐漸增強，試驗中，85 ℃時對亞硝酸鹽清除達到最大值，但在95 ℃溫度下亞硝酸鹽清除率開始略有下降。

圖2 不同水浴溫度對亞硝酸鹽清除率的影響

2.1.3 pH對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

由圖3可知，pH在9～12的范圍內，亞硝酸鹽清除率逐漸增加，pH達12時，亞硝酸鹽清除率達到最大值74.88%，隨后略有下降。出現該種現象的原因可能是：利用鹽酸萘乙二胺法來測定亞硝酸鹽時，必須是在堿性條件下進行，但是若堿性過強，則會對反應的穩定性和活性物質的活性產生一系列消極影響，從而使得亞硝酸鹽清除率下降。通過與其他四大單因素試驗結果的比較發現，不同pH對于亞硝酸鹽清除率的影響差別不夠大，并且在最佳pH條件對亞硝酸鹽清除率只達74.88%，相對于其他因素對于亞硝酸鹽清除率的最大值而言該清除率較低，因此，該單因素不作為主要影響因素。

圖3 不同pH對亞硝酸鹽清除率的影響

2.1.4 水浴時間對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

由圖4可知，在30 min中內，亞硝酸鹽清除率呈現先升高后降低趨勢，并在15 min時清除率達到最大值73.23%，隨著水浴時間的增加和水浴溫度的升高，香蔥提取液中活性物質的結構遭到破壞，從而降低亞硝酸鹽清除率。

圖4 不同水浴時間對亞硝酸鹽清除率的影響

2.1.5 反應時間對香蔥提取液清除亞硝酸鹽的影響

由圖5可知，在5～15 min范圍內，亞硝酸鹽清除率快速上升，反應時間15 min時，亞硝酸鹽清除率達到最大值87.97%，之后反應時間越長亞硝酸鹽清除率越低，這可能是由于反應時間過長，反應向著逆反應方向進行，由此導致亞硝酸鹽清除率降低。

圖5 不同反應時間對亞硝酸鹽清除率的影響

2.2 Box-Behnken試驗設計與結果分析

2.2.1 Box-Behnken試驗設計方案與結果

由單因素試驗結果，經Design-Expert 13統計分析軟件設計出的試驗方案及試驗結果見表2，以香蔥提取液用量（A）、水浴溫度（B）、反應時間（C）為自變量，亞硝酸鹽清除率（Y）作為響應值優化香蔥提取液清除亞硝酸鹽的條件。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

2.2.2 Box-Behnken試驗回歸方程擬合與方差分析

使用Design-Expert 13響應面設計軟件，對香蔥提取液反應的各種因素和水平進行設計后，對所得數據進行回歸分析，回歸分析結果如表3所示，并測定所有組的響應值，擬合優化得出二次多項回歸方程：Y=86.49+2.59A-0.1150B+2.46C-1.33AB+0.02255AC-0.1625BC-7.31A2-8.39B2-5.39C2。

表3 回歸模型及方差分析

回歸模型的R2=0.9923，Radj2=0.9825，由方差分析可知，該回歸模型的P＜0.001，方程模擬達到極顯著，但失擬項P=0.1464＞0.05，不顯著，這表明該回歸方程擬合度較高，與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，能夠對亞硝酸鹽清除率進行可靠預測，也說明該回歸方程用于不同條件下香蔥提取液對亞硝酸鹽清除率影響的響應面優化試驗的理論推測可行。

由表3方差分析結果可知，FA=59.04，FB=0.12，FC=53.05，可得FA＞FC＞FB，即影響亞硝酸鹽清除率因素的主次順序為A＞C＞B，即香蔥提取液用量＞反應時間＞水浴溫度。一次項中A（香蔥提取液用量）、C（反應時間）對亞硝酸鹽清除率的影響極顯著（P＜0.01），但B（水浴溫度）對亞硝酸鹽清除率的影響不顯著。這可能是由于利用水浴法制備香蔥提取液時溶出物（有效活性物質）的量是固定的，不會因為溫度的變化而有大幅改變，或是說明溶出物（有效活性物質）耐熱性較高，不因為溫度高而失活。在交互作用中，AB表現為顯著（P＜0.05），但AC、BC間的交互作用不顯著，二次項A2、B2、C2表現為極顯著（P＜0.01），表示香蔥提取液用量及水浴溫度不同時，亞硝酸鹽清除率受到的影響無法由簡單的線性關系表示，并且香蔥提取液用量和水浴溫度的交互作用對亞硝酸鹽清除率影響顯著。但是對于其他兩對交互因素而言，則是主要考慮各自的主效應影響。

2.2.3 響應面圖分析

為研究亞硝酸鹽清除率中各因素的交互作用，由試驗設計所得響應面曲線圖和等高線圖如圖6所示。

圖6 各因素對亞硝酸鹽清除率的交互作用影響的響應面曲線圖和等高線圖

由圖6（C）可知，亞硝酸鹽清除率隨著香蔥提取液用量的增加，水浴溫度的變化使得亞硝酸鹽清除率呈現逐漸升高再逐漸降低的趨勢，有明顯弧度的曲面，說明香蔥提取液用量和水浴溫度對亞硝酸鹽清除率的影響較大；由圖6（A和B）可知，在相同反應時間和香蔥提取液用量的條件下，亞硝酸鹽清除率隨著水浴溫度的增加變化幅度不算大，兩兩數據見相差較小，香蔥提取液用量對其影響大于反應時間；由圖6（B和C）可知，保持香蔥提取液用量和水浴溫度相同的情況下，隨著反應時間的增加，亞硝酸鹽清除率先上升再有小幅下降，反應時間對其影響大于水浴溫度的影響；等高線圖的形狀可以反映出不同因素間的交互作用強弱，即圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。由此，圖6（C）的等高線圖呈橢圓形，可知AB的交互作用顯著，但圖6（B和A）的等高線圖偏向于圓形，說明AC、BC的交互作用不顯著，分析結果與方差分析結果一致。

2.2.4 驗證試驗

采用Design-Expert 13軟件對香蔥提取液清除亞硝酸鹽反應條件試驗模型進行分析，得到香蔥提取液清除亞硝酸鹽的最佳反應條件：水浴溫度84.771 ℃，香蔥提取液用量3.180 mL，反應時間16.140 min，亞硝酸鹽清除率被預測為87.01%。為驗證香蔥提取液清除亞硝酸鹽反應條件響應面優化模型的準確性和方便操作，調整驗證參數：水浴溫度85 ℃、香蔥提取液用量3 mL、反應時間16 min，進行驗證試驗。在實際試驗操作中測得的亞硝酸鹽清除率為86.35%，預測值與實際值較為接近，表明回歸方程可以反映各因素對香蔥提取液清除亞硝酸鹽能力的影響，具有實際應用價值。

3 結論

試驗證明香蔥提取液對于亞硝酸鹽有一定的清除能力，通過單因素試驗得到最佳反應條件，即反應時間15 min、香蔥提取液用量3 mL、水浴溫度85 ℃、水浴時間15 min、pH 12。在單因素試驗結果中，確定香蔥提取液用量、反應時間、水浴溫度為主要影響因素，通過三因素三水平響應面法優化得到的反應條件是水浴溫度85 ℃、香蔥提取液用量3 mL、反應時間16 min。在此條件下，香蔥提取液對香腸中亞硝酸鹽清除率達到最大。