雜化納米生物催化劑CALB@Fe3O4@ZIF-8 的構建及性能

杜英杰 ，賈曉彤，羅秀艷，崔建東，賈士儒，龔 棟

(1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 湖北漢江大健康產業有限公司，十堰 442000；3. 天津益倍生物科技集團有限公司，天津 300457)

作為生物活性大分子，游離酶具有高效性、專一性和反應條件溫和的優點，但在工業中使用有易失活、回收困難、不能反復利用、不易于產物分離提純和精制、成本高等明顯缺點[1-2]。將酶固定化可為酶提供一個相對穩定的環境，這不僅減少了酶在實際使用過程中的流失，還能提高酶的相對穩定性以及重復使用性[3]。將酶固定在固體載體上，能更有效控制反應過程并提高酶在儲存和操作條件下的穩定性。此外，固定化酶可以更容易從產品中分離出來，有效降低生產成本[4]。

目前，固定化酶的常用方法有多種[5-8]，其中新型包埋法使用各種多孔納米材料，如無定形磷酸鈣[9]、有機-無機雜化納米花[10]、金屬有機骨架(metalorganic framework，MOF)[11]等用于酶的固定化。金屬有機骨架納米材料作為酶固定化的載體具有生物親和性高、制備過程簡單、可修飾等優勢，但是存在顆粒小、難回收、較低的酶負載率等問題，在一定程度上限制了其在固定化酶領域的應用。將MOF 與其他功能納米材料相雜化，制備復合納米材料，不僅可以保持MOF 材料的優良性能，還可以體現功能材料的特性，在酶的固定化領域具有較好的應用前景。ZIF-8 是MOF 材料的一種，它是由六水合硝酸鋅和2-甲基咪唑在常溫下通過有機物和無機金屬離子配位合成的金屬骨架材料。ZIF-8 原料價格低廉，合成條件簡單易改進，因而十分適用于固定化酶的開發。當前，將大分子酶固定于MOF 材料上實現MOF 材料作為載體的固定化酶生物催化劑的構建已成為研究熱點之一[12-13]。然而，單一ZIF-8 材料仍然存在一些常見問題，例如MOF 材料的酸堿穩定性較差、顆粒小、機械強度較低等，這在一定程度上限制了它們的應用范圍。因此，將MOF 與其他功能納米材料相雜化，制備復合納米材料，不僅可以保持MOF 材料的優良性能，還可以體現功能材料的特性，對于提高酶固定化載體的性能具有重要意義。

盡管MOF 固定化酶策略能改善酶的穩定性，但往往存在較低的酶負載率、較大的傳質阻力、難以簡單回收并重復利用以及制備過程難以精確控制等因素，造成催化效率較低[14]。金屬納米粒子Fe3O4作為一種功能化材料，具有反式尖晶石結構和穩定的化學性質、良好的生物相容性、一定的光熱效應和磁響應性能，在物理、化學、生物、醫藥等諸多領域受到廣泛關注。Hou 等[15]在Fe3O4表面修飾了MOF 涂層制備固定化酶，利用Fe3O4的磁性特性，在磁場的控制下可以使固定化酶被快速分離。Ricco 等[16]對Fe3O4納米粒子進行了聚多巴胺修飾，并在其表面涂覆了MOF 材料構建多層核殼結構材料，實現了高穩定性固定化胰蛋白酶的制備。Zhao 等[17]在溫和條件下一步包埋Fe3O4納米粒子和酶分子，構建ZIF-8 基的磁性固定化酶。他們發現Fe3O4納米粒子的加入影響了ZIF-8 的晶體和孔隙結構，更有利于底物的傳入和產物的傳出，使催化劑展示出較高的催化活力。因此，將Fe3O4納米粒子和酶共同包埋在MOF 材料中，形成酶/Fe3O4/MOF 復合雜化生物催化劑，能夠使復合雜化生物催化劑具有多波長光效應和磁響應的特點。同時，在一定光照條件下，Fe3O4納米粒子在催化劑內部產生局部熱量，提升催化劑催化微環境的溫度，進而提高固定化酶生物催化劑的酶活力。開展納米馬達雜化MOF 固定化酶的可控制備及其構效關系探究，對于開發新型高效納米固定化酶具有重要意義。

本研究以脂肪酶(CALB)為模型酶，在功能性納米材料Fe3O4納米粒子與ZIF-8 納米材料相雜化的同時，將脂肪酶包埋在ZIF-8 中，制備雜化納米生物催化劑(CALB@Fe3O4@ZIF-8)。采用的脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)作為一種有專一性、高效性和環境友好性特點的催化劑[18-19]，被廣泛應用于食品、化工、皮革和生物能源等工業領域。構建的新型雜化材料固定化酶與傳統僅將脂肪酶包埋在ZIF-8中的催化劑(CALB@ZIF-8)相比，該催化劑具備以下特性：作為生物親和性好的載體，ZIF-8 納米材料的包埋可以為脂肪酶分子提供良好的保護作用；Fe3O4納米粒子的光熱效應可以為脂肪酶提供程度可控的微環境水平熱量供給，提升酶的催化活力；同時，其磁響應特性有利于生物催化劑的回收和重復利用。

1 材料與方法

1.1 材料

脂肪酶來源于伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia，貨號534641)，Sigma 公司；曲拉通X-100(Triton X-100)，北京索萊寶科技有限公司；2-甲基咪唑(2-MeIM)、六水合硝酸鋅、異硫氰酸熒光素(FITC)、棕櫚酸對硝基苯酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；FeSO4·7H2O、Na2HPO3·12H2O、無水乙醇、NaH2PO3·2H2O，福晨(天津)化學試劑有限公司；氮氣，天津市軍糧城常福氣體有限公司；鹽酸，國藥集團化學試劑有限公司。

CHF-XM500 型氙燈光源，北京泊菲萊科技有限公司；UV-6100 型紫外分光光度計，上海美普達儀器有限公司；EMS-20 型數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，上海喬躍電子有限公司；JJ-1B 型恒速電動攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；pHSJ-4A 型pH 計，上海精密科學儀器有限公司；D8 Advance 型傅里葉變換紅外光譜儀，Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 Fe3O4 納米粒子的制備

取濃鹽酸與水等體積混合，配制6 mol/L 的鹽酸溶液，用所配制的鹽酸溶液滴入50 mL 超純水中，直到pH＝2.5～3.5，將1.67 g FeSO4·7H2O 加入上述溶液中溶解。打開機械攪拌裝置，水浴鍋水溫25 ℃，向三口燒瓶中加入混合溶液，三口燒瓶一口蓋上玻璃塞，中間連接攪拌槳，另一口連接氮氣裝置，驗證裝置氣密性后通入氮氣10 min。待排出空氣后，打開攪拌裝置，轉速400 r/min，打開玻璃塞，在體系中添加亞硝酸鈉0.21 g，立即密封玻璃塞，調節水浴鍋溫度至40 ℃，隨后加入25 mL 25%氨水，機械攪拌2 h。將懸浮液倒入離心管中用釹磁鐵分離，回收磁性粒子，倒出廢液，超純水洗滌2 次，無水乙醇洗滌2 次，每次均進行磁場分離，最后保存到無水乙醇中，得Fe3O4納米粒子分散液，4 ℃保存。

1.3 CALB@ZIF-8 及CALB@Fe3O4@ZIF-8 的制備

1.3.1 CALB@ZIF-8 的制備

取89.2 mg Zn(NO3)2·6H2O 與5 mL 超純水混合，另取239.1 mg 2-MeIM 與10 mL 超純水混合，取脂肪酶30 mg 與10 mL 超純水混合，得到3 mg/mL的酶液。在200 r/min 機械攪拌和水浴鍋25 ℃條件下，向100 mL 三口燒瓶中加入1 mL 酶液和9 mL pH為7 的100 mmol/L PB 緩沖液，待溶解后用移液管滴加 Zn(NO3)2溶液；攪拌 30 min 后取出，25 ℃、8 680 r/min 離心5 min；加入25 mL 超純水分散沉淀，倒入三口燒瓶中，打開機械攪拌，保持上述溫度，移液管滴加制備好的10 mL 2-MeIM 溶液，攪拌2 h 后將反應液取出；在10 000 r/min、25 ℃的條件下離心10 min，收集沉淀備用[20]。

1.3.2 CALB@Fe3O4@ZIF-8 的制備

取一定量的Fe3O4納米粒子分散液，釹磁鐵分離去除無水乙醇，用去離子水洗滌2 次，加入1 mL PB緩沖液(pH 7.0，100 mmol/L)后超聲40 min 備用。在機械攪拌條件下，向100 mL 三口燒瓶中加入1 mL質量濃度同1.3.1 節中的酶液、離心后的1 mL Fe3O4納米粒子分散液和8 mL PB 緩沖液(pH 7.0，100 mmol/L)，其后實驗步驟參照1.3.1 節。

1.4 CALB酶活力測定方法

CALB 酶活力測定參考Gao 等[21]的測定方法：將制備的固定化酶離心后所獲得的沉淀溶解，為待測酶液，向PB 緩沖液(pH 7.5，100 mmol/L)中加入0.4%的乳化劑Triton X-100。將0.015 1 g 棕櫚酸對硝基苯酯溶于3 mL 無水乙醇中，得到13.33 mmol/L底物。

在5 mL 離心管中加入1.15 mL 上述加入乳化劑的混合溶液和0.1 mL 底物，在37 ℃的條件下預熱3 min 后加入0.25 mL 酶液，反應3 min 后迅速在410 nm 波長下以水替代酶液并加入等量底物標零，測定吸光度。

CALB 酶活力定義：在37 ℃條件下1 min 內轉化棕櫚酸對硝基苯酯生成1μmol 對硝基苯酚所需的酶量為1 U。酶活力換算公式為

式中：Y為酶活力，U；A為吸光度；k為標準曲線的斜率；c為標準曲線的截距；N為酶液的稀釋倍數。

1.5 制備條件對酶催化性能的影響

1.5.1 溫度對固定化酶催化性能的影響

制備固定化酶CALB@ZIF-8 和CALB@Fe3O4@ZIF-8 時，設置溫度為15、20、25、30、35 ℃，在無光條件和380 nm 光照條件下測定吸光度，并通過式(1)計算酶活力。

1.5.2 轉速對固定化酶催化性能的影響

在上述實驗基礎上，分別在200、250、300、350、400 r/min 轉速下制備固定化酶 CALB@ZIF-8 和CALB@Fe3O4@ZIF-8，測定酶活力，酶活力測定方法參見1.4 節。

1.5.3 光照條件對固定化酶催化性能的影響

在上述實驗基礎上，將制備的固定化酶CALB@ZIF-8 和CALB@Fe3O4@ZIF-8 在無光條件、自然光條件以及380、435、475、650 nm 下測定酶活力，酶活力測定方法參見1.4 節。

1.5.4 Fe3O4質量對固定化酶催化性能的影響

在上述實驗基礎上，分別稱取Fe3O4納米粒子3、4、5、6、7 mg 制備固定化酶CALB@Fe3O4@ZIF-8，并在380 nm 光照條件下測定酶活力，酶活力測定方法參見1.4 節。

1.6 酶促反應動力學測定

棕櫚酸對硝基苯酯的濃度分別設置為6、8、10、12、14 mmol/L，實驗開始3 min 后讀取吸光度，按照1.4 節方法分別測定在以上不同底物濃度下脂肪酶的酶促反應速率，根據吸光度計算對硝基苯酚生成量[21]。以1/c為橫坐標、1/v為縱坐標，根據雙倒數作圖法計算vmax和Km[24]。

式中：v為酶促反應速率，vmax為最大酶促反應速率，單位均為mol/(L·min)；Km為米氏常數，mol/L；c為底物濃度，mol/L。

2 結果與分析

2.1 四氧化三鐵的透射電鏡觀察

為考察四氧化三鐵納米粒子的粒徑和形貌，對其進行了透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)分析，結果如圖1 所示。

圖1 四氧化三鐵透射電鏡圖Fig. 1 TEM image of Fe3O4

由圖1 可知，四氧化三鐵納米粒子粒徑約為30 nm，但呈現部分團聚現象，這可能會造成包埋的效果不理想，因此在包埋前需要對Fe3O4進行超聲等預處理，使其更加分散。

2.2 固定化CALB催化劑的表征

利用透射電鏡考察了兩種固定化酶催化劑的形貌，結果如圖2 所示。由圖2(a)和圖2(b)可知，CALB@ZIF-8 呈現為球狀，CALB@Fe3O4@ZIF-8 也呈現為球狀，粒徑約為200 nm，且顆粒內部分布著的黑色斑點是更小的Fe3O4納米顆粒物。由透射電鏡圖片可知，Fe3O4納米顆粒被雜化到ZIF-8 中。

圖2 固定化酶催化劑的表征結果Fig. 2 Characterization results of immobilized enzyme catalyst

為了驗證脂肪酶被固定在ZIF-8 中，對脂肪酶用異硫氰酸熒光素進行了標記，透析后進行固定化操作，并用激光共聚焦顯微鏡進行了觀察，結果如圖2(c)所示。在CALB@Fe3O4@ZIF-8 中可以觀察到大量綠色熒光，表明脂肪酶被包埋固定在了ZIF-8 中。

對兩種固定化酶催化劑進行了傅里葉變換紅外光譜表征，結果如圖2(d)所示。在610 cm-1處的吸收峰說明了Fe—O 鍵的形成，在421 cm-1處的振動峰對應著N—Zn 鍵，在1 310 cm-1、1 420 cm-1處的振動峰對應著咪唑環，在1 655 cm-1處存在酰胺鍵紅外吸收峰，表明脂肪酶被固定，進一步證明了Fe3O4雜化ZIF-8 復合納米材料的成功制備。

2.3 CALB@Fe3O4@ZIF-8 制備條件優化

溫度、轉速、光照條件和Fe3O4質量對固定化CALB@Fe3O4@ZIF-8 酶活力的影響如圖3 所示。

圖3 溫度、轉速、光照條件和Fe3O4 質量對固定化CALB@Fe3O4@ZIF-8 酶活力的影響Fig. 3 Effect of temperature，string speed，light condition and Fe3O4 during immobilization process on the activities of CALB@Fe3O4@ZIF-8

2.3.1 溫度

溫度作為固定化酶制備的關鍵條件之一，往往會影響固定化酶的催化活力和穩定性，因此有必要對固定化過程中的溫度對固定化酶酶活力的影響進行考察，從而獲得最佳的固定化溫度。如圖3(a)所示，在30 ℃條件下制備的CALB@ZIF-8 酶活力達到最高值，在無光條件下和380 nm 光照條件下的酶活力分別是75 U 和85 U。相比而言，在20 ℃條件下制備的CALB@Fe3O4@ZIF-8 的酶活力達最高值，在無光條件下和380 nm 光照條件下的酶活力分別是102 U 和113 U。這可能是由于Fe3O4的光熱效應對酶分子的構象產生影響，使其更適于在較低溫度下進行固定化[22]。在光照條件下，Fe3O4納米粒子可以在局部空間內為酶分子提供納米粒子的微熱效應，進而提升酶的催化活力。因此，選擇20 ℃作為制備溫度。

2.3.2 轉速

在制備固定化酶的過程中，轉速也是一個重要影響因素，適當的攪拌可以使體系混合得更均勻，使反應平穩進行。如圖3(b)所示，轉速條件的變化對其酶活力影響較為顯著。固定化酶 CALB@ZIF-8 在250 r/min 制備時酶活力達到最大值191 U，但隨著轉速增加，酶活力下降，這可能是因為過高的轉速破壞了固定化酶的結構。CALB@Fe3O4@ZIF-8 的酶活力隨著轉速的增大而逐步提高，在400 r/min 時酶活力最大。這個結果表明：功能化Fe3O4納米粒子與MOF材料的雜化可能有益于固定化酶結構的穩定。因此，選擇400 r/min 作為制備轉速。

2.3.3 光照條件

光照條件是表現本催化劑的光熱效應的關鍵因素，功能化Fe3O4納米粒子具有光熱效應，可協助實現催化劑產生局部熱，光照條件的變化會改變其局部空間，為酶分子提供微熱效應。由圖3(c)可知：游離酶和 CALB@ZIF-8 受光照影響不顯著，但是CALB@Fe3O4@ZIF-8 受光照條件影響較為顯著，其在 380 nm 下酶活力達到最高值(149 U)，高于CALB@ZIF-8 酶活力最高值(128 U)，游離酶酶活力為181 U，最大酶活回收率為82%，比優化前提高了16%。這可能是因為功能化Fe3O4納米粒子的光熱效應帶入MOF 材料固定化酶中，為內部酶分子帶來了局部熱量，大大提高了固定化酶的酶活力[23]。因此，光照條件選擇380 nm。

2.3.4 Fe3O4質量

Fe3O4作為功能化納米粒子具有光熱效應，可使金屬有機骨架材料的部分原有性能增強，甚至使復合材料集成新的性能，形成具有優異協同性能的復合材料。由圖3(d)可知：酶活力隨著Fe3O4質量的增加而逐步上升，在5 mg 時達到最高值(149 U)，隨后逐步下降。因此，制備固定化酶CALB@Fe3O4@ZIF-8 的最優Fe3O4添加質量為5 mg。

2.4 CALB@Fe3O4@ZIF-8 的酶學特征

CALB@Fe3O4@ZIF-8 的重復使用性、儲藏穩定性、pH 耐受性以及溫度穩定性如圖4 所示。

圖4 CALB@Fe3O4@ZIF-8 的重復使用性、儲藏穩定性、pH耐受性以及溫度穩定性Fig. 4 Reusability，storage stability，pH tolerance and temperature stability of CALB@Fe3O4@ZIF-8

2.4.1 重復使用性

固定化酶的重復利用不僅可以為生產節約成本，而且符合綠色生產的理念。本研究固定化酶的重復使用性結果如圖4(a)所示，合成的CALB@Fe3O4@ZIF-8 經過7 次重復使用后，其相對酶活力還能保持在84.29%，而CALB@ZIF-8 經過7 次重復使用后，其相對酶活力保持在82.01%。這說明合成的CALB@Fe3O4@ZIF-8 擁有優異的重復使用性。

2.4.2 儲藏穩定性

儲藏穩定性是衡量固定化酶性能的重要指標，本研究固定化酶的儲藏穩定性結果如圖4(b)所示，CALB@Fe3O4@ZIF-8 在儲存14 d 后，相對酶活力還能保持85%，CALB@ZIF-8 在儲存14 d 后，相對酶活力還能保持79%，游離酶在儲存2 d 后相對酶活力明顯下降，儲存8 d 后相對酶活力僅剩8%，表明CALB@ Fe3O4@ZIF-8 具有較好的儲藏穩定性。

2.4.3 pH 耐受性

pH 對CALB@Fe3O4@ZIF-8 催化劑酶活力的影響結果如圖4(c)所示。CALB@Fe3O4@ZIF-8 的最適催化pH 為7，隨著pH 的升高酶活力下降。CALB@ZIF-8 的趨勢與CALB@Fe3O4@ZIF-8 大致相同，都有較好的pH 耐受性，當pH 為11 時，還有67%相對酶活力，而游離酶受pH 影響較大，pH 穩定性較差。

2.4.4 溫度穩定性

CALB@Fe3O4@ZIF-8 的溫度穩定性結果如圖4(d)所示，延長高溫處理時間，圖中CALB@Fe3O4@ZIF-8 在55 ℃條件下處理50 min 后，仍有73%相對酶活力，對比相同處理時間的CALB@ZIF-8 63%相對酶活力，游離酶在處理50 min 后仍有42%相對酶活力，表明此材料具有較好的溫度穩定性。

2.5 酶促反應動力學實驗

生物催化劑的動力學參數見表 1。CALB@Fe3O4@ZIF-8 在380 nm 下的Km值(3.205 5 mol/L)小于CALB@Fe3O4@ZIF-8 自然光下的Km值(3.711 4 mol/L)，也小于CALB@ZIF-8的Km值(5.355 5 mol/L)，說明在光照條件下，固定化材料與底物的親和力增強。這可能是由于光照使得雜化納米材料中納米馬達產生局部熱效應，從而使被包埋固定在其中的脂肪酶在內部的運動增強且減少團聚，降低了傳質阻力，提高了親和力，從而導致Km降低。但是，與游離脂肪酶vmax∶Km值0.003 2 min-1相比，CALB@Fe3O4@ZIF-8在380 nm 下表現出更高的vmax∶Km值(0.006 6 min-1)，這說明光照給了固定化材料更高的催化效率。

表1 生物催化劑的動力學參數Tab. 1 Kinectics parameters of biocatalysts

3 結 語

本文利用包埋法構建功能性Fe3O4納米粒子雜化ZIF-8 固定化酶催化劑，研究了溫度、攪拌轉速、Fe3O4添加質量對催化劑催化性能的影響，探討了光照條件對固定化酶酶活力的影響。

(1)制備CALB@ZIF-8 最優條件為：溫度30 ℃、轉速 250 r/min、光照波長 380 nm。制備 CALB@Fe3O4@ZIF-8 的最優條件為：溫度 20 ℃、轉速400 r/min、光照波長380 nm、Fe3O4質量為5 mg。

(2)Fe3O4納米粒子的雜化顯著提高了固定化酶CALB@Fe3O4@ZIF-8 的酶活力，且光照對CALB@Fe3O4@ZIF-8 酶活力的影響較為明顯，特別是光強及波長對固定化酶酶活力有顯著提高的作用。

(3)光照后包埋Fe3O4納米粒子的固定化酶與底物有更高的親和力，且提高了最低酶促反應速率。