3-芳基取代脯氨酸的合成

＊冉冬梅 吳譚林 劉伊琳 馮若昆

（紹興文理學院化學化工學院 浙江 312000）

近年來，氨基酸作為組成多肽的重要結構單元而被廣泛應用于小分子藥物的合成中[1]，越來越多的生物制劑如多肽、蛋白質以及單克隆抗體被應用于臨床醫學中，在醫療和保健方面發揮著越來越重要的作用[2-4]。脯氨酸是一種重要的環狀氨基酸，由脯氨酸合成的多肽相較于由直鏈氨基酸合成的多肽，其不僅可以增加多肽的細胞膜滲透性還可以抵御蛋白質水解作用[5]。另外脯氨酸也是重要的手性催化劑以及配體[6-8]，在不對稱有機合成中發揮著重要的作用。3-芳基取代的脯氨酸根據其取代基的不同，可以直接影響其合成藥物的生物活性[9]，如圖1所示，I是一種黑素皮質激素-4受體（MC4R），II是一種單胺再攫取抑制劑[10]，研究發現前者具有減輕體重和減少食物攝入的功效，還可以用于治療癌癥惡化等病癥。此外，近期的研究還表明其對治療焦慮和抑郁有奇效[11]。因此研究3-取代脯氨酸的合成新方法，拓展該類化合物的合成，具有相當重要的科研意義和廣泛的應用價值。

圖1 含有3-芳基取代脯氨酸的藥物分子結構

傳統合成3-芳基取代脯氨酸的方法主要為分子間環化法[10]，該反應路線不僅反應原料昂貴不易得、反應步驟較長、反應效率較低，而且產物的手性難以控制，探索發展簡便、快捷、高效的合成3-取代脯氨酸的方法顯得非常重要。

近年來，由于過渡金屬催化的碳氫鍵活化反應與傳統偶聯反應相比具有明顯的優勢，而受到科研工作者的青睞。隨著研究的深入，基于該方法的各種偶聯反應在合成天然產物、藥物分子及有機材料方面取得了極大的發展。結合本課題組及Bull課題組在鈀催化的脯氨酸碳氫鍵官能化反應的研究[12]，本文擬利用碳氫鍵活化的方法，以脯氨酸為母體，通過在脯氨酸上引入相應的導向基團和保護基團實現脯氨酸3-位的碳氫鍵芳基化反應，而后，利用簡便的方法一步實現引入基團的脫除，高效地制備相應的3-芳基取代的脯氨酸化合物，并對其生物活性進行初步探索。

1.實驗部分

(1)主要儀器與試劑

DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；400MHz核磁共振譜儀（TMS為內標，瑞士Bruker公司，AVANCE Ⅲ）。

脯氨酸，8-氨基喹啉，碘苯，對甲基碘苯，對氯碘苯，對氟碘苯，對溴碘苯，3,4-二氯碘苯，3,4-二氟碘苯，2-碘吡啶，2-碘噻吩；乙醇，二氯甲烷，石油醚，乙酸乙酯。

(2)實驗方法

①3-芳基-2-(喹啉-8-基氨基甲酰基)-吡咯烷-1-甲酸芐基酯（3aa-3ai）的合成

稱取2-(喹啉-8-基氨基甲酰基)-吡咯烷-1-甲酸芐基酯（0.5mmol）、碘代芳烴（1.0mmol）、醋酸銀（1.0mmol）、醋酸鈀（5mol%）加入到厚壁耐壓管中，用0.25mL甲苯作為反應溶劑并放入小磁子，在110℃油浴中攪拌反應24h后冷卻至室溫。加入10mL乙酸乙酯到反應液中，然后用硅藻土過濾并用20mL乙酸乙酯洗脫兩次，合并濾液在減壓條件下用旋轉蒸發儀除去溶劑得到粗物質。將粗物質通過快速色譜柱純化得到純化合物。

②3-芳基取代脯氨酸的合成

稱取上述產物（0.2mmol）、氫氧化鈉（4mmol）加入到厚壁耐壓管中，用2mL乙醇作反應溶劑，加入小磁子在100℃油浴中攪拌混合直至反應物反應完全。然后待反應液冷卻至室溫加入30mL二氯甲烷稀釋，再加入30mL水。分離出二氯甲烷有機層，再往剩余的水層中加入稀鹽酸直至pH=1。用二氯甲烷萃取剩余水相，合并二氯甲烷有機相用無水硫酸鎂干燥0.5h以上并過濾，然后將濾液用旋轉蒸發儀在減壓條件下除去溶劑得到純3-芳基取代脯氨酸固體。

(3)實驗數據

3-苯基脯氨酸（86%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.02～2.15(m,1H),2.34～2.42(m,1H),3.33～3.52(m,3H),4.25～4.27(m,1H),7.22～7.30(m,5H)。

3-對甲苯基脯氨酸（88%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.21(m,1H),2.34(m,3H),2.50(m,1H),3.56～3.67(m,3H),4.31(m,1H),7.32(m,4H)。

3-對氟苯基脯氨酸（78%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.33～2.41(m,1H),2.63～2.69(m,1H),3.62～3.69(m,1H),3.75～3.83(m,2H),4.48～4.51(m,1H),7.27～7.31(m,2H),7.55～7.58(m,2H)。

3-對氯苯基脯氨酸（81%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.33～2.41(m,1H),2.64～2.69(m,1H),3.64～3.68(m,1H),3.75～3.83(m,2H),4.49～4.65(m,1H),7.51～7.57(m,4H)。

3-對溴苯基脯氨酸（82%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.32～2.40(m,1H),2.62～2.68(m,1H),3.64～3.68(m,1H),3.73～3.81(m,2H),4.43～4.64(m,1H),7.60～7.68(m,4H)。

3-(3,4-二氯苯基)脯氨酸（69%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.02～2.13(m,1H),2.36～2.44(m,1H),3.33～3.40(m,1H),3.48～3.55(m,2H),4.32～4.54(m,1H),7.15～7.18(m,1H),7.39(d,J=8.4Hz,1H),7.44～7.18(m,1H)。

首先給拐杖終端接上電源,當衛星導航數據有效后,LCD液晶顯示屏上顯示當前的時間、空間信息,并同時顯示測得的體溫信息以及心率信息,同時會將信息傳遞至遠程的手機端軟件上。

3-(3,4-二氟苯基)脯氨酸（73%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.12～2.16(m,1H),2.36～2.44(m,1H),3.35～3.42(m,1H),3.50～3.56(m,2H),4.26(d,J=10.0Hz,1H),7.15～7.18(m,1H),7.39(d,J=8.4Hz,1H),7.44-7.18(m,1H)。

3-(2-噻吩基)脯氨酸（82%）:1H NMR(D2O,400Hz)δ2.22～2.29(m,1H),2.47～2.56(m,1H),3.44～3.51(m,1H),3.55～3.61(m,1H),3.90～3.96(m,1H),4.23～4.25(m,1H),7.00～7.02(m,1H),7.07～7.08(m,1H),7.35～7.36(m,1H)。

3-(2-吡啶基)脯氨酸（5 6%）:1H N M R(-D2O,400Hz)δ2.48～2.81(m,3H),3.60～3.74(m,2H),4.09～4.23(m,1H),8.00～8.12(m,2H),8.61～8.76(m,1H),9.14～9.23(m,1H)。

2.結果與討論

(1)反應底物篩選

研究表明，保護基團和導向基團是影響脯氨酸直接碳氫鍵官能化反應的關鍵因素，因此，在研究之初首先要對脯氨酸上引入的基團進行篩選。根據本課題組前面的工作，發現8-氨基喹啉作為導向基團時，反應具有較高的產率，而且該基團易于脫除。而對于保護基團來說，如圖2所示，當分別使用氯甲酸芐酯（Cbz-Cl），芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl），二碳酸二叔丁酯（Boc2O）以及特戊酰氯（Piv-Cl）作為脯氨酸氨基的保護基團時，發現當使用特戊酰氯作為保護基團時反應產率最高為71%。然而特戊酰氯作為保護基團時，產物在后續保護基團的脫除時所用條件較為苛刻，而且得到的產物為三氟乙酸的鹽不易于產品純化。雖然N-Cbz保護的脯氨酸原料發生芳基化反應時產率較低，但是Cbz易于脫除，而且條件簡便，有利于該反應的拓廣。因此，選用Cbz作為保護基團，通過對反應催化劑，氧化劑以及溶劑的優化得到較佳的反應條件，從而合成一系列3-芳基取代的脯氨酸。

圖2 保護基團的影響

(2)3-芳基取代脯氨酸的合成

經過條件優化，發現當降低甲苯的用量時，反應產率呈上升趨勢，當甲苯的用量降低到0.25mL時，產率最高，達到83%。在得到最佳反應條件后，合成了一系列3-芳基脯氨酸衍生物，如圖3所示。

圖3 脯氨酸衍生物3-芳基脯氨酸的合成

(3)3-芳基取代脯氨酸細胞毒性考察

①細胞培養。A549和NCI-H460人非小細胞肺癌細胞購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。細胞培養于添加了胎牛血清（10%，v/v）、NaHCO3（2g/L）、谷氨酸（2mM）、青霉素（100kU/L）、鏈霉素（100kU/L）的RPMI-1640培養基中，在5% CO2含量及37℃的恒溫培養箱中培養。

③細胞毒活性結果。以A549和NCI-H460人非小細胞肺癌細胞為模型，采用MTT法評價了合成的3-芳基取代脯氨酸化合物的細胞毒活性。從細胞生長曲線可以看出，化合物作用48h后，A549和NCI-H460細胞的存活率均呈現出濃度依賴的降低，但幾種化合物的IC50值均大于400μM，如圖4所示，這暗示著其具有低的細胞毒性。

圖4 細胞毒性測試

3.結論

本文利用過渡金屬催化的碳氫鍵活化反應，通過在脯氨酸母體上引入保護基團及導向基團，從而實現脯氨酸3-位的碳氫鍵活化芳基化反應，合成了3-芳基取代的脯氨酸衍生物，而后通過一步反應脫除引入基團，簡便快捷高效地實現了3-芳基取代脯氨酸的合成，并對該類化合物的細胞毒性進行了考察。此外，本課題組還在探索此類化合物的其他生物活性。