基于三苯胺的新型銅離子熒光探針及其接力識(shí)別硫離子研究

＊史嫣然 高妍 尉樺聰 劉靜逸 劉定坤 高云

（遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 遼寧 114051）

引言

近年來(lái)由于許多生物化學(xué)過(guò)程都涉及分子識(shí)別，因此能夠用于識(shí)別陽(yáng)離子和陰離子的熒光分子探針的研究已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注[1]。作為生物體中必需的微量元素，Cu2+存在于各種生物酶中，如細(xì)胞色素氧化酶和氨基氧化酶等[2]。Cu2+濃度過(guò)低會(huì)引起代謝紊亂，甚至導(dǎo)致疾病或死亡，心腦血管疾病也與人體缺乏Cu2+密切相關(guān)。然而，Cu2+濃度過(guò)高也會(huì)引起許多疾病包括阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥和帕金森病[3]。因此Cu2+的檢測(cè)對(duì)人類(lèi)健康具有重要意義。硫化氫（H2S）是一種具有臭雞蛋臭味的有毒氣體[4]。在食品樣品中，這種氣體含有機(jī)硫的食品，如雞蛋、肉類(lèi)、蔬菜、水果等自然產(chǎn)生的。H2S是通過(guò)調(diào)節(jié)生理代謝和提高抗氧化酶活性來(lái)延長(zhǎng)蔬菜和水果的貯藏時(shí)間[5]。雖然H2S有利于食品的儲(chǔ)存，但它對(duì)一些飲料和食品有不利影響[6]。因此，對(duì)H2S的檢測(cè)可以作為衡量食品新鮮度的重要指標(biāo)。在本研究中，以三苯胺作為熒光團(tuán)，引入咪唑作為識(shí)別基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一種通過(guò)“開(kāi)-關(guān)-開(kāi)”的方式接力識(shí)別Cu2+和H2S的新型熒光分子探針。

圖1 探針SYR接力識(shí)別Cu2+及S2-的傳感機(jī)制

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)熒光探針SYR的合成

圖2 探針SYR的合成路線(xiàn)

探針SYR的合成：將按照已報(bào)道方法[7]合成的4-[4-(二苯基氨基)苯基]-2-羥基苯-1-甲醛（0.365g，1mmol）、雙（2-吡啶基）甲酮（0.184mg，1mmol）和乙酸銨（0.231g，3mmol）溶解在15mL乙酸溶液中，加熱回流6h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物倒入到冰水混合物中，然后用40% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性并用二氯甲烷進(jìn)行萃取，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，旋干，用硅膠色譜柱進(jìn)行純化得黃綠色目標(biāo)產(chǎn)物SYR，產(chǎn)率為78%。通過(guò)探針SYR的1H NMR(DMSO-d6,400MHz)和13C NMR(DMSO-d6,101MHz)，計(jì)算得出探針SYR的相對(duì)分子質(zhì)量為：531.2185，根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)探針SYR的相對(duì)分子質(zhì)量為：531.2177。

2.結(jié)果與討論

(1)熒光探針SYR對(duì)Cu2+的紫外光譜響應(yīng)

如圖3（a）所示，在DMF緩沖溶液中，探針在358nm處有一強(qiáng)的吸收峰，隨著Cu2+濃度的增加，358nm的吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱，并且波長(zhǎng)發(fā)生一定程度的紅移，當(dāng)加入的Cu2+達(dá)到1.4μL后，吸收光譜基本不再變化，在292nm和379nm出現(xiàn)兩個(gè)等吸收點(diǎn)。圖3（a）中插圖為探針識(shí)別銅離子的顏色響應(yīng)，不加Cu2+時(shí)探針呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，加入Cu2+后，探針溶液呈現(xiàn)淡藍(lán)色。如圖3（b）所示，加入等當(dāng)量的如Zn2+、Hg2+、Mg2+、Pb2+、Ni2+、Fe2+等其他金屬離子后，探針的紫外光譜幾乎沒(méi)有改變，只有加入Cu2+后探針的紫外吸收強(qiáng)度明顯降低且波長(zhǎng)紅移。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針對(duì)Cu2+具有良好的專(zhuān)一識(shí)別能力。

圖3 （a）探針對(duì)Cu2+的紫外滴定光譜；（b）探針對(duì)Cu2+的紫外篩選光譜；（c）探針對(duì)Cu2+的熒光滴定光譜；（d）探針對(duì)Cu2+的熒光篩選光譜;（e）探針對(duì)Cu2+的線(xiàn)性方程；（f）探針對(duì)Cu2+濃度的線(xiàn)性方程

(2)熒光探針SYR對(duì)Cu2+的熒光光譜響應(yīng)

圖3（c）為熒光分子探針在DMF緩沖溶液中對(duì)Cu2+的熒光滴定譜圖，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著Cu2+的濃度逐漸增大，探針的熒光強(qiáng)度不斷降低，當(dāng)加入的Cu2+達(dá)到1.4μL時(shí)，有機(jī)小分子探針強(qiáng)度降到最低，熒光淬滅率為70.0%。同時(shí)，只有加入Cu2+后探針的熒光強(qiáng)度明顯降低（圖3（d）），表明探針SYR對(duì)Cu2+具有良好的專(zhuān)一識(shí)別能力。

依據(jù)熒光分子探針熒光強(qiáng)度隨Cu2+濃度的變化曲線(xiàn)，根據(jù)線(xiàn)性方程，按照探針與金屬離子2:1的配位模式進(jìn)行線(xiàn)性擬合（如圖3（e））。可計(jì)算出探針SYR識(shí)別Cu2+的絡(luò)合常數(shù)為3.46×105M-2。

COPD是一種以氣流受阻為特征慢性疾病，主要臨床表現(xiàn)有咳嗽、氣短、咳痰、呼吸困難等。COPD雖屬于氣道疾病，但可致全身性反應(yīng)[3]。肺康復(fù)治療是COPD防治的主要措施之一，但在我國(guó)，康復(fù)治療應(yīng)用較晚，目前尚缺乏規(guī)范化治療手段，且患者的治療依從性較差[4]。

為進(jìn)一步研究探針識(shí)別Cu2+的靈敏度，根據(jù)探針熒光強(qiáng)度隨Cu2+濃度的變化規(guī)律繪制工作曲線(xiàn)（圖3（f）），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cu2+在0～6μM范圍內(nèi)，分子探針的熒光強(qiáng)度與Cu2+的濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=197903X+290283，根據(jù)直線(xiàn)的斜率可擬合計(jì)算出探針識(shí)別Cu2+的最低檢測(cè)限為1.92nM。

(3)熒光探針SYR-Cu2+對(duì)S2-的紫外光譜響應(yīng)

考慮到S2-與Cu2+之間存在較強(qiáng)的親和力，采用紫外吸收光譜考察了SYR-Cu2+對(duì)S2-的識(shí)別性能如圖4（a）。隨著S2-（0～20μM）濃度的不斷增加，探針在390nm處的吸收強(qiáng)度逐漸降低，在355nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)加入的S2-達(dá)到15μM后，吸收光譜基本不再變化，且與探針的紫外光譜基本一致，這主要是由于S2-與Cu2+配位后將配體重新釋放出來(lái)，從而使得體系的紫外光譜恢復(fù)到與探針的基本一致。而加入其它陰離子如Br-、Cl-、F-、HSO4-、HCO3-、NO2-、Cys的加入對(duì)SYR-Cu2+的紫外光譜幾乎沒(méi)有影響，如圖4（b）。結(jié)果證明SYR-Cu2+對(duì)S2-具有較強(qiáng)的選擇性識(shí)別作用。

圖4 （a）探針SYR-Cu2+對(duì)S2-的紫外滴定光譜；（b）探針SYR-Cu2+對(duì)S2-的紫外篩選光譜；（c）探針SYR-Cu2+對(duì)S2-的熒光滴定光譜；（d）探針SYR-Cu2+對(duì)S2-的熒光篩選光譜

(4)熒光探針SYR-Cu2+對(duì)S2-的熒光光譜響應(yīng)

為了進(jìn)一步研究S2-的接力識(shí)別，采用熒光滴定法研究了SYR-Cu2+對(duì)S2-的鑒定。如圖4（c）所示。隨著S2-（0～20μM）的逐漸加入，SYR-Cu2+(10μM）的熒光強(qiáng)度逐漸增大，最后與分子探針SYR的熒光光譜基本一致。表明SYR-Cu2+可作為靈敏的化學(xué)傳感器來(lái)檢測(cè)S2-。另外，只有加入S2-后探針SYR-Cu2+的熒光強(qiáng)度明顯升高如圖4（d），利用線(xiàn)性擬合計(jì)算可求出SYR-Cu2+識(shí)別S2-的最低檢測(cè)限為2.57×10-8M。表明探針SYRCu2+對(duì)S2-具有靈敏的專(zhuān)一識(shí)別能力。

(5)熒光探針SYR對(duì)Cu2+的傳感機(jī)制研究

利用HR-MS研究了SYR對(duì)Cu2+的識(shí)別機(jī)制。如圖5所示，HR-MS分析表明[SYR+H+]+在m/z=531.2177處有一個(gè)分子離子峰。加入Cu2+后，m/z=1122.8404處的峰歸屬于[2SYR-2H++Cu2++H+]+，證實(shí)了SYR-Cu2+是按2:1的化學(xué)計(jì)量比配位而成的。

圖5 探針SYR識(shí)別Cu2+前后的HR-MS

3.結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一種以三苯胺作為熒光團(tuán)，咪唑作為識(shí)別基團(tuán)的新型熒光分子探針SYR。該探針能夠高靈敏的專(zhuān)一識(shí)別Cu2+，Cu2+的引入可使探針的熒光大幅淬滅，其識(shí)別機(jī)理為分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移（PET）機(jī)理。探針SYR與Cu2+的絡(luò)合模式為按2:1。當(dāng)Cu2+在0～6μM的濃度范圍內(nèi)SYR探針的熒光強(qiáng)度和Cu2+濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，經(jīng)擬合計(jì)算，絡(luò)合常數(shù)和檢測(cè)限分別為3.46×105M-2和1.92nM。生成的SYR-Cu2+對(duì)S2-表現(xiàn)出明顯的熒光增強(qiáng)反應(yīng)。探針SYR-Cu2+識(shí)別S2-的最低檢測(cè)限為2.57×10-8M。該熒光傳感器可后續(xù)應(yīng)用于實(shí)際水樣中Cu2+的檢測(cè)。本研究豐富了Cu2+和S2-的檢測(cè)手段，在生物傳感、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。