紫花苜蓿中黃酮類化合物分離及特殊顯色反應研究

＊趙 靜

（甘肅工業職業技術學院 甘肅 741025）

黃酮類化合物是一類天然存在于植物中的多酚化合物，具有多種生物活性，其具有抗氧化、抗炎癥、抗癌等多種藥理活性，對人類健康和植物生長具有積極影響。黃酮類化合物的分離和鑒定，對于理解紫花苜蓿的藥用價值以及牧草屬性具有關鍵意義。分離和鑒定紫花苜蓿中的黃酮類化合物通常需要復雜的分析技術，包括色譜學和質譜學等本研究旨在分離和鑒定紫花苜蓿中的黃酮類化合物，以及開發一種特殊顯色反應，用于定量分析這些化合物。這項研究將有助于深化對紫花苜蓿中潛在藥用成分的了解，同時提供了一種有力的技術手段，以促進相關研究以及藥物開發。

1.紫花苜蓿植物材料的準備

（1）植物采集。在紫花苜蓿植物材料的采集過程中，研究人員選擇了生長在適宜環境下的植株。采集時間被嚴格控制在紫花苜蓿的生長季節內，以保證樣本的最佳狀態。采集工作中，研究人員使用鋒利的剪刀和修枝工具，以最小化對植物的傷害[1]。為了確保后續實驗的可行性和可重復性，研究人員采集了足夠數量的植物材料，并在采集過程中特別注意保持樣本的完整性。

（2）樣品制備。在樣品制備階段，研究人員從采集得到的植物材料中精心選擇了健康且未受病蟲害侵害的樣本。在制備過程中，研究人員對植物材料進行了徹底的清潔，去除了土壤、塵埃和其他雜質，以確保樣本的純度。隨后，植物材料被精確地切割成適當大小的碎片或塊，為后續的分析和提取工作做好準備。每個樣本都被仔細標識，包括采集日期、采集地點和植物部位等關鍵信息，這些標識將幫助研究人員追溯樣品來源，保證實驗數據的準確性和可信度。

2.黃酮類化合物的分離和富集

(1)萃取方法

①提取。將樣品加入適量的提取溶劑，如乙醇或甲醇（通常是10～20mL），然后加入鹽酸（HCl）以維持酸性條件。此酸性條件有助于提高黃酮類化合物的溶解度。研究人員通常在室溫下使用聲波震蕩或超聲波浴加速提取，提取時間控制在15～30min。使用離心機分離上清液，上清液中含有黃酮類化合物。

②固相萃取（SPE）。準備SPE柱，典型的SPE填料是硅膠或C18柱，這些填料有助于吸附和分離黃酮類化合物。

在SPE柱上預先平衡，使用純溶劑如甲醇或乙醇。將上清液（提取液）通過SPE柱，使黃酮類化合物被吸附到SPE填料上。

③洗脫。使用適當的洗脫溶劑（醚或乙酸乙酯）沖洗SPE柱，將黃酮類化合物從填料中洗出，將洗脫液收集并濃縮。

④濃縮。使用氮氣吹掃或旋轉濃縮儀將洗脫液濃縮到適當的體積，通常是幾毫升。在濃縮液中添加內標物質，以用于定量分析，確保準確性[2]。將濃縮的樣品轉移到色譜管或瓶中，以便進行進一步的色譜分析或定量測定。

(2)分離和富集方法

①柱色譜技術。研究人員將植物樣品磨碎并適當稱量，以獲得準確的起始樣品質量。選擇適當的柱填料，通常是硅膠（SiO2）或C18填料。這些填料具有吸附性，可以用于分離黃酮類化合物。在使用柱之前，需要對柱進行預處理，通常使用純溶劑如甲醇或乙醇平衡柱。將制備好的樣品以溶解在適當的溶劑中的形式加載到柱上，樣品中的黃酮類化合物將與填料相互作用，并被吸附在柱上。通過使用不同極性的溶劑（通常是醚或乙酸乙酯），可以洗脫吸附的黃酮類化合物，從而分離它們。

②液液萃取。液液萃取是一種基于化合物在不同相間分配行為的有效分離和富集黃酮類化合物的方法。其關鍵步驟包括樣品制備，選擇適當的有機溶劑（例如乙醚或乙酸乙酯），樣品提取，離心分離過程，有機相（含黃酮類化合物）和水相（含其他雜質）分離。其中，萃取率的計算公式為：

有機相中含有目標黃酮類化合物，需要將其收集到另一個容器中，隨后通過氮氣吹掃或旋轉濃縮儀對其進行溶劑蒸發，將提取物濃縮至適當的體積。這個過程利用液液相互作用將目標化合物從植物樣品中分離出來，為后續的分析和研究提供了富集的樣品。其中，富集倍增計算公式為：

為確保液液萃取過程中不會出現缺少溶劑的情況，在開始萃取之前，研究人員需要準確計算溶劑消耗效率，其公式為：

(3)黃銅色素純化

黃銅色素的純化作為一種化學分離過程，通常采用柱層析技術。在這一過程中，使用特定的溶劑系統，即展開劑，以分離黃銅色素及其他組分。展開劑的選擇是關鍵因素，它通常包括多種有機溶劑或其混合物，如乙酸乙酯、丙酮和甲醇[3]。這些溶劑的選擇取決于黃銅色素和其他化合物的相對親和力和極性，通過調整它們的比例和性質，可以調控色素與柱填料之間的相互作用，實現不同成分的有效分離。

在柱色譜中，用于描述和控制黃銅色素移動的重要概念是Rf值（色素移動率）。Rf值是移動距離與溶劑前移距離之比，用公式（4）表示。

式中，Rf值是展開劑對移動速率和位置的影響的反映。通過比較黃銅色素與其他化合物的Rf值，可以評估它們之間的分離程度，并確定黃銅色素的位置。在實驗中，研究人員進行標準柱色譜實驗，測量黃銅色素相對于展開劑的Rf值，然后根據Rf值的大小，可以確定黃銅色素的位置和分離情況，從而進行有效的純化和收集。其中，不同溶劑的展開效果如表1所示。

表1 不同展開劑的展開效果

3.黃酮色素的紫外光譜分析

（1）實驗過程。為了進行紫外光譜分析，需要使用分光光度計。在分析前，分光光度計需要經過校準，并設置適當的參數，包括波長范圍和檢測器靈敏度。黃酮色素在紫外光區域（200～400nm）吸收較強，因此需要將分光光度計掃描范圍設定在這一區間。這個范圍的選擇允許研究人員獲取有關黃酮色素吸收特性的詳細信息。隨著波長的掃描，分光光度計會測量樣品對不同波長光線的吸光度。吸光度是光線經過樣品后被吸收的量，通常以A（吸光度）表示。這些吸光度數據被記錄下來，構成吸光度光譜[4]。在獲得吸光度光譜后，研究人員可以進行進一步的分析。通過觀察光譜的形狀和吸收峰的位置，可以推測黃酮色素的結構和化學性質。吸光度的最大值對應著黃酮色素的最大吸收波長，這是其特征性質之一。

（2）實驗結果。本次研究中，工作人員選擇分離效果較好的單一黃色譜帶，在溶液中加入乙醇，并使用超聲波進行過濾，對經過超聲波過濾的溶液進行甲醇溶解，并以甲醇作為參比在200～600nm波長范圍內進行紫外光譜對比，將該溶液與其他類型同類化合物甲醇溶液進行UV光譜對比，通過這種方式得到黃酮類化合物結構類型（詳見表2）。

表2 不同黃酮類化合物類型甲醇溶液UV光譜

（3）結果分析。根據所提供的UV光譜數據，對于不同黃酮類化合物的吸收特性進行了觀察和比較（如圖1所示）。

圖1 紫花荀蓿中黃酮色素的光譜圖

UV光譜是一種用于分析物質吸收光線的光學技術，由于不同化合物具有不同的吸收特性，因此可以通過觀察它們的光譜來推斷其結構。在這個情況下，考察的是紫花首蓿中的黃酮類化合物。根據所提供的UV光譜數據，可以得出以下結論：

①黃酮類化合物的吸收特性通常在兩個波段范圍內被觀察到，分別是帶Ⅰ（300～400nm）和帶Ⅱ（240～280nm）。這兩個波段代表不同的電子躍遷，其中帶Ⅱ通常對應著芳香環的π-π躍遷，而帶Ⅰ通常對應著非芳香環的n-π躍遷。

②黃酮和黃酮醇的UV吸收光譜表現出相似的特征，都在帶Ⅰ（300～400nm）和帶Ⅱ（240～280nm）范圍內顯示吸收峰。這些化合物的帶Ⅰ吸收峰紅移，即峰值在較長波長處。這可能是由于它們的芳香環結構引起的[5]。

③異黃酮和二氫黃酮的UV吸收光譜在帶Ⅰ和帶Ⅱ范圍內表現出一些不同。對于異黃酮，帶Ⅱ是主要吸收峰，而帶Ⅰ則是較弱的峰。相比之下，二氫黃酮的帶Ⅱ也是主要吸收峰，但其帶Ⅰ與帶Ⅱ相比更弱。

綜合以上觀察，紫花首蓿中的黃酮類化合物的UV光譜數據顯示出與異黃酮類化合物相似的特性。這是因為異黃酮的UV吸收光譜在帶Ⅰ為弱峰，帶Ⅱ為主峰的特點。因此，基于UV光譜數據的比較，可以得出結論：紫花首蓿中的黃酮類化合物的結構為芒柄花素的異黃酮類化合物。

4.結語

本次研究中，研究人員使用了多種化學技術，例如色譜分離、質譜分析和紫外光譜分析，以識別和分離黃酮類化合物。這些分析方法不僅幫助研究人員確定了紫花苜蓿中的黃酮類化合物的存在，還提供了有關它們的結構和性質的重要信息。通過了解這些化合物的結構，研究人員可以更好地理解其生物活性和潛在藥用價值。特殊顯色反應的研究也為研究人員提供了一種便捷而敏感的方法，用于檢測和測定黃酮類化合物。黃酮類化合物的特殊顯色反應也為快速、準確地檢測這些化合物提供了一種新途徑，有望在藥物研究、生態監測和植物保護等領域發揮重要作用。