基于AIE分子-適配體探針的銀離子檢測研究

＊金嘉杰 胡超 殷康 紀川 牛俊峰 孫海亞*

（1.浙江科技學院 生物與化學工程學院 浙江 310023 2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室 浙江 310023）

隨著中國經濟的快速發展，人口增長、工業化和城鎮化的快速推進，重金屬相關行業保持著較強的發展勢頭，而由此帶來的重金屬污染壓力正在不斷增加，尤其是在“十三五”期間，重金屬污染已成為中國正面臨的嚴峻環境問題[1,2]。現代工業的快速發展，使得工業生產帶來的重金屬污染越來越嚴重。它們可以通過皮膚、消化道、呼吸道等途徑進入到人和動物體內，對生物的生命健康產生了極大的影響[3]。重金屬離子的危害性主要表現為，能與人體內的多種蛋白質及酶產生強烈的相互作用，導致其變性失活。并且重金屬離子還在人體內進行累積，一旦重金屬離子的含量超出了人體的耐受極限，就會引起人體不同程度的中毒，給人帶來極大的傷害[4]。近年來中國學者對國內眾多水系進行了鎘、鉛、汞含量測定，結果表明，水質中的重金屬含量均有超標的現象[5]。另外，在日本水俁灣附近，含汞的工業廢水被排放到海水中。甲基汞由廢水中的無機汞轉化而來，并通過生物積累進入食物鏈，最終被人攝取，使人生病，成為全世界關注的水俁病[6]。

表1 飲用水標準中對常見重金屬的上限要求Tab.1 Upper limit requirements for common heavy metals in drinking water standards

隨著重金屬污染不斷加重，在提倡從根源上控制重金屬污染產生的同時，許多針對環境重金屬污染的檢測方法被提出并廣泛應用。目前，傳統的重金屬檢測方法主要有光譜法和電化學法，這些方法都有相同的不足就是操作復雜，成本高，且不能快速得到檢測結果，簡單、高效、低成本的重金屬檢測技術逐漸凸顯出它的重要性。隨著各學科領域的技術進步，多門學科整合并被利用到檢測技術當中，檢測技術逐漸走向多元化。如利用核酸適配體構建傳感器系統用于檢測[7]等。

1990年，美國的Gold[8]和Szostak[9]兩個研究小組先后獨立提出了核酸適配體（Aptamer）的概念，這是一種高特異性、高親和力的單鏈寡核苷酸，從人工合成的隨機寡核苷酸序列庫中篩選出來，具有能與靶分子（重金屬離子）特異性結合的特性，其長度一般在10 100個核苷酸[10]。利用核酸適配體的高特異性，建立一套針對特定物質的，高靈敏度的生物傳感檢測新方法。既能獲得較為優異的分析效果，又能保證操作方法的簡便性。同時，核酸適配體因其特殊的寡核苷酸特性，更易于對其進行結構改造，并能特異性地與多種靶標分子精準結合。由核酸適配體與多種現代分析檢測技術相結合得到的生物傳感器[11,12]，再配合上生物信號放大技術，就能夠構建出一套具有巨大應用潛力的高靈敏度檢測體系。

陽離子型聚集誘導發光分子是一種具有AIE特性的陽離子有機鹽，由具有AIE性質的四苯基乙烯[13]及4-吡啶甲醛組合而成。常規的熒光分子因其平面性及較強的分子間相互作用，其在單一分散時呈熒光，當其聚集時，分子的熒光強度會出現降低，甚至會導致熒光猝滅發生[14]，這就是所謂的“聚集猝滅熒光”（Aggregation-Caused Quenching，ACQ）。ACQ現象嚴重制約了有機發光材料的應用，而AIE分子則不會有這樣的問題。經過結構研究和試驗驗證，發現AIE分子的發光原理與ACQ分子截然不同，目前研究認為引起AIE分子固態發光的主要因素是分子內運動受限（Restriction of Intramolecular Motions，RIM），包括分子內轉動和振動受限。當分子聚集時，會消耗分子激發態能量的分子內運動被抑制，這極大地抑制了分子猝滅時的非輻射躍遷。此時，分子以輻射躍遷為主要方式釋放能量，分子發光[15]。這種特性為熒光檢測提供了條件，可以將AIE分子結合到生物大分子上以獲得高強度的熒光效果。在AIE分子聚集后，聚集物發出的熒光迅速增強，利用此特性，可以實現對特定物質含量進行直接的、定量的檢測。同時，AIE的發現為解決發光材料在聚集后發光性能衰退的問題提供了新的途徑，開辟了有機發光材料研發的新領域。基于上述結果，2017年中國科學最高獎“國家自然科學一等獎”授予中國香港科技大學唐本忠院士帶領的團隊，獎勵他們在“聚集誘導發光”研究領域做出的世界領先科研成果[16,17]。目前，AIE材料已經在生物檢測與成像等研發領域取得巨大突破，生物細胞成像[18]、診斷治療[19]、細胞示蹤[20]、致病菌鑒別與檢測[21]等利用AIE材料的新興技術被廣泛運用于醫療事業當中。

本項目擬采用適配體技術與聚集誘導發光技術相結合的新方法用于水溶液中銀離子的檢測。目標建立一套全新的具有高選擇性的且能夠快速、定量檢測水溶液中重金屬離子濃度的方法，并提供一套針對銀離子的專一性AIE 適配體復合探針體系及成熟的制備方法。

1.試驗部分

(1)主要原料、試劑和試驗設備

表2 主要原料和試劑Tab.2 Main raw materials and reagents

表3 主要試驗儀器Tab.3 Main experimental instruments

(2)陽離子型AIE分子的合成

AIE材料的分子結構如圖1。引用文獻的合成方法：2,4 二甲基四苯基乙烯經NBF、BPO催化能夠生成2,4二溴甲基四苯基乙烯，經亞磷酸三乙酯催化反應后，能與吡啶苯基甲醛進行反應生成特定的四苯基乙烯衍生物，將該衍生物與RX進行取代后即可獲得試驗所需的陽離子型AIE分子。對所得產物結構進行表征，其結果如下：1H-NMR(500MHz,DMSO,δ):8.85(d,4H,Pyridine H),8.18(d,4H,Pyridine H)，7.92～7.01(m,22H,Ar-H,-CH=CH-)。結果與參考文獻[22]報道一致。

圖1 陽離子型AIE分子Fig.1 Cationic AIE molecule

(3)溶液的配制

①緩沖液配制

稱取4.000g氫氧化鈉，溶解在100mL超純水中，配置成濃度為1×10-3mol/L的氫氧化鈉溶液。將0.5950g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸固體溶于400mL超純水中，并用配好的NaOH溶液調節pH值，使溶液在25℃時的pH為7.4±0.1，最后以超純水稀釋，定容至500mL。配置HEPES緩沖液。

②溶液配制

將陽離子型AIE分子（8.20mg）溶于50mL超純水中，轉移定容至100mL，配置成濃度為1×10-4mol/L的陽離子型AIE分子溶液。將裝有定制核酸適配體的離心管置于離心機中，以轉速4000rpm離心1min，加入353μL配置好的Tris溶液，配置成濃度為1×10-4mol/L的核酸適配體的HEPES溶液。兩溶液均在4℃冰箱冷藏保存。

取一定量配置好的陽離子型AIE分子溶液與核酸適配體溶液混合，稀釋在HEPES緩沖溶劑中，配成AIE分子濃度為1×10-5mol/L，核酸適配體濃度為1×10-6mol/L的熒光探針溶液。

取10μL濃度為0.1mol/L的硝酸銀溶液，稀釋到1000μL，配置成濃度為1×10-3mol/L的稀硝酸溶液，密封避光存儲。

(4)光譜測試

①紫外光譜測定

將一定濃度的陽離子型AIE溶液以及AIE分子與適配體呈一定配比的熒光探針溶液分別在Hepes溶液中分散均勻，振蕩3mim，裝入比色皿中，室溫下測試其吸收光譜，記錄最大吸收峰波長數。掃描范圍在200～800nm。

②熒光光譜測定

基于紫外光譜測得的最大吸收峰波長數，對熒光探針分子及探針體系進行多項熒光光譜檢測。試驗中儀器的激發波長為390nm，掃描范圍在410～750nm，激發狹縫和發射狹縫寬度均為5nm。

將一定濃度的陽離子型AIE樣品在5mLVTHF：VH2O=9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、1:19、1:99的溶液中分散均勻，振蕩3min，裝入比色皿中，室溫下測試其發射光譜。

將不同濃度梯度的陽離子型AIE分子溶液與固定濃度的核酸適配體溶液在Hepes溶液中分散均勻，振蕩3min，裝入比色皿中，室溫下測試其發射光譜，并找出復合探針體系中適配體濃度與陽離子型AIE分子濃度的最佳配比。

(5)重金屬離子的檢測

①復合探針體系與不同濃度Ag+相互作用的熒光強度變化的檢測。依次取一定劑量的AgNO3溶液加入2mL復合探針溶液中混合均勻，振蕩3min，測定不同銀離子濃度下，復合溶液的最大熒光強度的變化情況。

②其他金屬干擾離子對復合探針體系與Ag+離子相互作用的干擾情況檢測。分別配置10倍于銀離子濃度的Na+、K+、Mg2+、Al3+、Cd2+、Pb2+、Hg2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、NH4+的金屬離子水溶液，并與銀離子溶液等比例混合。取相同劑量的上述金屬離子混合溶液加入到2mL復合探針溶液中混合均勻，振蕩3min。比較各組溶液熒光強度變化的差異程度，分析不同的金屬干擾離子是否會對復合探針體系與Ag+的特異性結合帶來干擾。

(6)探針檢測限的計算

復合探針體系對Ag+離子的檢測限（LOD）根據公式（1）計算：

式中：σ表示不加Ag+離子時空白探針體系（陽離子型AIE分子濃度為1.6×10-5mol/L，核酸適配體濃度為1×10-6mol/L）的熒光強度標準偏差；k表示探針在線性范圍（0.011～0.540mg/L）內的斜率。

2.結果與討論

(1)陽離子型AIE分子與復合探針分子的AIE性質

圖2（a）為陽離子型AIE分子的吸收光譜與熒光光譜圖。相關結果如下：在200 ～800nm吸收光譜掃描范圍內，陽離子型AIE分子的最大吸收峰對應波長為390nm，摩爾消光系數為2.631×106mol·L-1·cm-1，吸收波段覆蓋300～500nm，表明分子對近紫外光和藍紫色可見光有較好的吸收。以390nm作為檢測儀器的激發波長，將激發和發射的狹縫寬度均設定為5nm，收集熒光光譜圖上波長410～750nm掃描范圍內的數據并分析。陽離子型AIE分子在波長為580nm左右的位置有最大發光強度峰，發光顏色接近紅色，Stokes位移為190nm。較大的Stoke位移可避免生物大分子自發光和入射光對熒光發射的影響。

圖2 陽離子型AIE分子的吸收光譜與熒光光譜（a）及在不同THF/H2O比例溶液中AIE分子的最大發光強度變化圖（b）Fig.2 Absorption spectrum and fluorescence spectrum of cationic AIE molecule(a) and variation of maximum fluorescence intensity of AIE molecules in solutions with different THF/H2O ratios(b)

圖2（b）為AIE分子在不同THF/H2O比例溶液中的最大發光強度變化圖。本課題的陽離子型AIE分子在作為良性溶劑的水中發出微弱的光或不發光，但是隨著溶液中作為不良溶劑的四氫呋喃（Tetrahydrofuran，THF）的比重不斷增加，熒光分子的熒光強度顯著增強。由圖3可見，在純水溶液中，樣品的熒光強度極弱。在THF體積分數低于50%時，溶液的熒光強度隨不良溶劑比例的增大而顯著增大，但始終較低。在THF體積分數高于50%后，熒光分子的聚集程度逐漸達到最大，熒光分子在580nm處的發光強度緩慢增強并最終趨于穩定，溶液保持著較大的熒光強度，這一現象與文獻報道一致[23]，這正是AIE分子特有的熒光性質，陽離子型AIE分子在水中溶解性較好，在四氫呋喃中溶解性較差，因此隨著溶液中THF的比例不斷升高，陽離子型AIE分子發生聚集，自身運動受阻，從而使得熒光強度顯著增強。

圖3 陽離子型AIE分子濃度對復合熒光探針體系最大發射強度的影響Fig.3 the effect of the concentration of cationic AIE molecules on the maximum fluorescence intensity of the composite fluorescent probe system

(2)AIE探針與單鏈適配體的相互作用

圖4為陽離子型AIE分子濃度對復合熒光探針體系最大發射強度的影響變化圖。如圖4所示，向核酸適配體溶液中加入陽離子型AIE分子溶液（016μmol/L）時，隨著陽離子型AIE分子濃度的增加，復合體系的熒光強度穩步增強。陽離子型AIE分子溶液的濃度在超過16μmol/L后，其熒光強度變化不大，且受限于陽離子型AIE分子在水中的溶解度，復合熒光探針體系的熒光強度有所下降。這說明此時陽離子型AIE分子與核酸適配體通過靜電復合作用的結合，已達到飽和，即AIE分子與核酸適配體的最大結合比趨向于16:1。所以，選定陽離子型AIE分子濃度為16μmol/L，核酸適配體的濃度為1μmol/L的探針溶液作為標準復合熒光探針體系，用于后續對探針與銀離子相互作用情況的關系探究。

圖4 復合熒光探針體系在加入銀離子后最大發射強度的變化情況Fig.4 Changes in the maximum fluorescence intensity of the composite fluorescent probe system after the addition of silver ions

(3)AIE-適配體復合探針對銀離子的檢測

①銀離子的定量檢測

加入不同濃度梯度的銀離子后，熒光探針體系的熒光強度迅速降低。經多次試驗測試發現，在3min左右，探針體系的熒光強度降至最低水平并且保持恒定的熒光強度。這說明對于復合熒光探針體系來說，核酸適配體可以準確地與銀離子結合，同時釋放出陽離子型AIE分子，導致熒光猝滅發生，溶液熒光強度下降。另外也說明，該復合熒光探針體系對重金屬Ag+離子的檢測能力良好且快速，最后將檢測時間定位為3min[24]。

圖5為復合熒光探針體系在加入銀離子后最大發射強度的變化情況。分析圖中數據可以看出，復合熒光探針體系的熒光強度隨著銀離子質量濃度的增加而逐漸減弱。在銀離子質量濃度低于0.011mg/L時，探針體系的熒光強度整體下降偏快，而在銀離子質量濃度高于0.011mg/L時，復合探針體系熒光強度穩定下降。從線性擬合的結果來看，當銀離子質量濃度高于0.011mg/L時，探針體系熒光強度與銀離子質量濃度具有良好的線性關系（R2=0.9897）。另外，基于實驗數據，可推算出該體系對銀的最低檢出限（LOD）為0.010mg/L，該LOD值低于生活飲用水衛生標準的最低值，這為快速高效地檢測生活飲用水中的重金屬銀離子含量的實際應用奠定了基礎。

圖5 復合熒光探針體系選擇性干擾測試的最大發射強度比Fig.5 Maximum fluorescence intensity ratio for selective interference testing of composite fluorescent probe systems

②復合探針體系的選擇性檢測

為了檢驗復合探針體系對銀離子的特異性識別能力，選取了一些廢水中常見的金屬離子對復合熒光探針體系的選擇性進行干擾性試驗檢測，結果見圖5。將10倍于銀離子濃度的干擾金屬離子溶液與銀離子溶液等比例混合，這些金屬離子包括Na+、K+、Mg2+、Al3+、Cd2+、Pb2+、Hg2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、NH4+。取一定量金屬離子混合溶液加入到2mL復合探針體系中，充分振蕩混合，比較各組溶液熒光強度的數值大小。從圖5可以看出，除了鉛與汞離子以外，大多數常見金屬離子對復合探針體系的熒光強度干擾不大，充分說明該復合熒光探針體系對銀離子的檢測具有良好的選擇性。

3.結論

本文通過多步合成，制備了陽離子型AIE分子。然后將其與定制的核酸適配體通過靜電作用組合，配制成了一種具有AIE效應的復合熒光探針體系。該探針體系在核酸適配體的濃度為1μmol/L，AIE探針濃度為16μmol/L時達到最大結合比。在加入銀離子后，該復合體系中的核酸適配體會優先和銀離子發生特異性結合，釋放出陽離子型AIE熒光分子，從而導致AIE分子發生熒光猝滅，使體系熒光強度降低。利用此特性，可以實現對待測樣本溶液銀離子濃度的定量檢測。復合探針體系對Ag+的檢測限為0.010mg/L，線性范圍為0.011～ 0.540mg/L，對銀離子的檢測具有較好的選擇性，較低的檢測限以及較寬的檢測范圍。同時，實驗結果也證明了大部分其他的金屬離子對銀離子的檢測干擾程度較小，因此具有在自然環境水體中實際應用的潛力。本工作為利用AIE技術快速高效地檢測日常用水中的重金屬Ag+離子含量的實際應用奠定了基礎。